研究发育生物学的模式生物.ppt

Developmental Biology 理想的研究系统是科学发展的关键。在发育生物学的形成和发展过程中，理想的研究系统是科学发展的关键。在发育生物学的形成和发展过程中，许多划时代的突破往往与一些模式物种相关。许多划时代的突破往往与一些模式物种相关。今天，当我们回顾精子和卵子的发现及精卵受精这一重大发育生物学问题今天，当我们回顾精子和卵子的发现及精卵受精这一重大发育生物学问题的诠释时，就会想起的诠释时，就会想起1 9世纪后期一批欧洲胚胎学家用世纪后期一批欧洲胚胎学家用海胆海胆(seaurchin)所进行所进行的一系列观察；的一系列观察；当我们津津乐道当我们津津乐道1 995年度的诺贝尔奖获得者年度的诺贝尔奖获得者Ed，ward BLewis、Christiane NussleinVolhard和和Eric FWieschaus关于早期胚胎发育基因调关于早期胚胎发育基因调控的重大发现时，无不羡慕他们继承了基因学说的创建者控的重大发现时，无不羡慕他们继承了基因学说的创建者FhomlaS Hunt Morgaln等的优良传统，选用等的优良传统，选用果蝇果蝇这一绝好的模式动物；这一绝好的模式动物；当当1 997年和年和1 998年全世界的人们惊叹克隆羊、克隆牛和克隆鼠的诞生及年全世界的人们惊叹克隆羊、克隆牛和克隆鼠的诞生及体细胞克隆技术日臻成熟时，发育生物学研究者所思索的则是体细胞克隆技术日臻成熟时，发育生物学研究者所思索的则是20世纪六七十世纪六七十年代英国发育生物学家年代英国发育生物学家John Gurdon用用非洲爪蟾非洲爪蟾这一有着王者之称的模式这一有着王者之称的模式脊椎动物所进行的有关体细胞核移植的开创性研究工作。脊椎动物所进行的有关体细胞核移植的开创性研究工作。特别是特别是20世纪世纪90年代分子发育生物学兴起后，模式生物显得更为重要。年代分子发育生物学兴起后，模式生物显得更为重要。Developmental Biology第一节第一节 华美广杆线虫华美广杆线虫Developmental Biology一华美广杆线虫的分类地位一华美广杆线虫的分类地位 华美广杆线虫是一种长为华美广杆线虫是一种长为1 mm，自由生活于土壤，自由生活于土壤中的小线虫，隶属于线形动物门中的小线虫，隶属于线形动物门(Nemathelminthes)线虫线虫纲纲(Nematoda)小杆线虫目小杆线虫目(Rhabditida)广杆线虫属广杆线虫属(Caenorhabditis)。就其与人类的关系来说，华美广杆。就其与人类的关系来说，华美广杆线虫在现已记录的大约线虫在现已记录的大约2万种万种(估计可能有估计可能有4万万1 000万万种种)线虫中，并不是最重要的线虫，所以在我国，即使线虫中，并不是最重要的线虫，所以在我国，即使是从事生命科学研究的学者对其还相当陌生。然而，线是从事生命科学研究的学者对其还相当陌生。然而，线虫的确与人类生活密切相关。一提起寄生于人类肠道中虫的确与人类生活密切相关。一提起寄生于人类肠道中的蛔虫、钩虫和蛲虫及寄生于人的淋巴系统内的丝虫曾的蛔虫、钩虫和蛲虫及寄生于人的淋巴系统内的丝虫曾经给人类带来的危害和痛苦，有谁会不为之惧怕呢经给人类带来的危害和痛苦，有谁会不为之惧怕呢?其其实这些病原寄生虫都属于线虫一类。不同的是，华美广实这些病原寄生虫都属于线虫一类。不同的是，华美广杆线虫不是寄生线虫，而是生活于土壤中、以细菌为食杆线虫不是寄生线虫，而是生活于土壤中、以细菌为食的一种自由线虫。的一种自由线虫。Developmental Biology二作为模式生物的优点二作为模式生物的优点近30年来的研究表明，华美广杆线虫的确是分子发育生物学及细胞生物学、分子生物学和神经生物学研究的极好模型。Developmental Biology作为模式生物，华美广杆线虫的主要优点如下：可在实验室用培养皿培养。由于以细菌为食，在实验室培养时，可在实验室用培养皿培养。由于以细菌为食，在实验室培养时，一般是先让琼脂培养皿长满细菌，再接种线虫。一般是先让琼脂培养皿长满细菌，再接种线虫。生命周期短生命周期短(一般为一般为3.5d)，胚胎发育速度快。在培养温度为，胚胎发育速度快。在培养温度为1 6度，胚胎发育期为度，胚胎发育期为1 8h；在培养温度为；在培养温度为25度，胚胎发育期为度，胚胎发育期为1 2 h。Developmental Biology 存在雌雄同体存在雌雄同体(1lermaphrodite)和雄性两类不同生物型，和雄性两类不同生物型，主要是雌雄同体生物型。主要是雌雄同体生物型。在雌雄同体生物型中，每尾线虫既含有卵子又含有精在雌雄同体生物型中，每尾线虫既含有卵子又含有精子，精卵在体内受精，胚胎在生殖腺管内发育，幼虫由子，精卵在体内受精，胚胎在生殖腺管内发育，幼虫由阴门阴门(vulva)产出。雌雄同体个体自体受精的结果可产生产出。雌雄同体个体自体受精的结果可产生非常纯合的基因型。雌雄同体个体性别决定的染色体机非常纯合的基因型。雌雄同体个体性别决定的染色体机制为制为XX型。在偶然情况下，可产生大约型。在偶然情况下，可产生大约O2的的XO雄性个体。雄性个体。XO雄性个体可与雌雄同体个体交配产生后代，雄性个体可与雌雄同体个体交配产生后代，从而增加了基因重组和新等位基因引入的机会。从而增加了基因重组和新等位基因引入的机会。体细胞数量少，由于透明可见，易于追踪细胞分裂体细胞数量少，由于透明可见，易于追踪细胞分裂谱系。产出的幼虫含有谱系。产出的幼虫含有556个体细胞和个体细胞和2个原始生殖细胞，个原始生殖细胞，幼虫经幼虫经4次蜕皮后变为成虫。若成虫为雌雄同体个体，则次蜕皮后变为成虫。若成虫为雌雄同体个体，则含有含有959个体细胞和大约个体细胞和大约2000个生殖细胞；若成虫为雄性个生殖细胞；若成虫为雄性个体，则含有个体，则含有103 1个体细胞和大约个体细胞和大约1 000个生殖细胞。个生殖细胞。Developmental BiologyDevelopmental Biology能观察到生殖细胞的发生及种质颗粒的传递过程。能观察到生殖细胞的发生及种质颗粒的传递过程。胚胎发育的细胞分裂为不对称分裂，种系(germ1ine)细胞中的种质颗粒(germlinegranule)或P颗粒。(Pgranule)在细胞分裂过程中仅分配到形成种系细胞的细胞质中。细胞谱系研究表明，受精卵(又称为P0种系细胞)的第一次卵裂产生AB创建者细胞和种系细胞P1，种系细胞P1再次分裂后形成创建者细胞EMS和种系细胞P2，P2进一步分裂后形成创建者细胞C和P3种系细胞，P3种系细胞再分后形成D创建者细胞和P4种系细胞。到幼虫产出时，AB细胞经分裂和进一步分化产生包括皮下细胞、神经细，胞、咽肌细胞、分泌腺细胞和1个体肌细胞在内的共389个细胞；EMS细胞经分裂为MS和E2个创建者细胞后，MS细胞再经分裂和分化出包括体肌细胞、咽肌细胞、神经细胞和分泌腺细胞在内的80个细胞，E细胞则形成构成肠子的20个细胞；C细胞经分裂和分化出包括皮下细胞、体肌细胞和2个神经细胞在内的47个细胞；D细胞则形成20个体肌细胞；而此时种系细胞P4才开始分裂出2个生殖细胞Z2和Z3。Developmental Biology三基因组大小及其基因组成三基因组大小及其基因组成华美广杆线虫是继病毒、细菌和酿酒酵母之后华美广杆线虫是继病毒、细菌和酿酒酵母之后基因组已经被完整测序了的第一个多细胞动物，基因组已经被完整测序了的第一个多细胞动物，其基因组由其基因组由97兆碱基组成。在这兆碱基组成。在这97兆碱基中，兆碱基中，预计含有预计含有1 9 099个编码蛋白的基因，即平均每个编码蛋白的基因，即平均每5 kb含有含有1个基因。每个基因平均含有个基因。每个基因平均含有5个内含子，个内含子，基因组的基因组的27被预期的外显子占据。被预期的外显子占据。与以前基于部分少量序列所作的估计相比，由完整基因组序列所预测的基因数要多得多。其基因量大约是酿其基因量大约是酿酒酵母的酒酵母的3倍，是人类的倍，是人类的1513。Developmental Biology将华美广杆线虫中的18891个蛋白与酿酒酵母的6217蛋白、大肠杆菌的4289个蛋白及目前可利用的人类的4979个蛋白进行比较分析后发现，人的4979个蛋白中有74可在线虫中找到对应蛋白，线虫有36的蛋白可在现知的人类蛋白中找到相关蛋白。总的比较结果表明，较小的基因组有较多的组分与较大的基因组相匹配，且较大的基因组含有更多可与之对应的蛋白。有趣的是，线虫中没有发现在酿酒酵母和大肠杆菌中都能与之匹配的蛋白。当然，尽管线虫的基因组已全部测序，但已做过遗传分析的蛋白基因还只占其基因总数的1025。因此，有关线虫基因的真正研究可以说是刚刚开始，前面还有很长的路要走。Developmental BiologyDevelopmental Biology黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)果蝇的分类地位归属于节肢动物门、昆虫纲、双翅目、果蝇科、果蝇属，其学名全称为黑腹果蝇，现一般简称果蝇。其名字源于它喜好腐烂的水果以及发酵的果汁，是一种原产于热带或亚热带的蝇种。它和人类一样分布于全世界，并且在人类的居室内过冬。第二节果蝇Developmental Biology一果蝇的两个重大贡献一果蝇的两个重大贡献谈起果蝇，已学过遗传学的人大概无人不知。自1910年遗传学泰斗ThomasHuntMorgan发现其第一个突变体白眼果蝇以来，其作为模式生物的历史已有90多年。正是以它为模式生物，Morgan和他的一批弟子们才从有关性连锁、性染色体、多线染色体和伴性遗传等遗传规律的发现中提出了基因论，奠定了现代遗传学的基础，并由此使Morgan获得了获得了1 933年的诺贝尔生理和医学奖年的诺贝尔生理和医学奖。也就是从那时开始，生物学家才普遍认识到模式生物在生命科学研究中的重要作用。Developmental Biology1978年长期在美国加州理工学院从事果蝇遗传和发育研究的EdwardBIewis采用饱和诱变的方法随机破坏近一半的果蝇基因，然后通过显微观察来研究和分析影响体轴形成和分节模式的基因，并由此鉴定出15种不同的由于突变引起体节缺陷的基因。很快，人们在其他高等生物和人类细胞中发现了同样的或类似的基因，并证明这些基因在发育过程中执行了相似的功能。这两位用果蝇作为模式生物开创分子发育生物学研这两位用果蝇作为模式生物开创分子发育生物学研究的学者就是究的学者就是1 995年与年与LewiS一起分享诺贝尔生理和医学一起分享诺贝尔生理和医学奖的奖的Christiane NussleinV01hard和和EricWieschaus.Developmental Biology二、果蝇的生命周期果蝇的生命周期在室温下一般为2周左右。成虫产出的受精卵只经ld的胚胎发育就孵化出幼虫；幼虫经历两次蜕皮，由第一期幼虫经第二期幼虫约3d时间发育成第三期幼虫，第三期幼虫再经23d的化蛹过程形成蛹；在蛹中约经过历时5d的变态，然后孵出成虫。成虫孵出后在1214h内开始交配产卵，产出的受精卵又开始进入下一个生命周期(图43)。果蝇成虫的长度为2mm，大约可存活9d左右。Developmental BiologyDevelopmental BiologyDevelopmental Biology三果蝇作为模式生物的优点三果蝇作为模式生物的优点（1）果蝇的生命周期短，在实验室条件下，一般）果蝇的生命周期短，在实验室条件下，一般12 d就就可完成一次世代交替。可完成一次世代交替。（2）个体小）个体小(成虫的长度仅为成虫的长度仅为2 mm)，给予很少一点适宜，给予很少一点适宜食物在实验室就能饲养一大群。食物在实验室就能饲养一大群。（3）具有几十个易于诱变分析的遗传特征，并保持有大）具有几十个易于诱变分析的遗传特征，并保持有大量的突变体。量的突变体。（4）有比较简单的染色体组成，只有）有比较简单的染色体组成，只有4对染色体，且唾腺对染色体，且唾腺细胞中含有巨大的多线染色细胞中含有巨大的多线染色(p01ytenic chromosome)o ，(5)卵子发生过程中已为早期胚胎发育积累了充分的养料，卵子发生过程中已为早期胚胎发育积累了充分的养料，且产出的卵子大，易于又见察。且产出的卵子大，易于又见察。(6)胚胎发育速度快，前胚胎发育速度快，前13次卵裂每次只间隔次卵裂每次只间隔9min，细胞，细胞核成倍增加成为一个合胞体核成倍增加成为一个合胞体(syncytium)，其胚胎发育过程，其胚胎发育过程是观察分析卵裂、早期胚胎发生和躯体模式形成等发育调是观察分析卵裂、早期胚胎发生和躯体模式形成等发育调控机制的绝佳材料。控机制的绝佳材料。，(7)幼虫存在变态过程，是分析器官芽幼虫存在变态过程，是分析器官芽(imaginal disc)细胞细胞增殖机制的理想模型。增殖机制的理想模型。Developmental Biology主要优点主要优点1.体积小，易于繁体积小，易于繁 殖；殖；2.产卵力强；产卵力强；3.性成熟短；性成熟短；4.易于遗传操作：易于遗传操作：如诱变；如诱变；5.基因组序列已全基因组序列已全 部测出部测出(Science,Mar.24,2000)。(120Mb encodes 13,601 proteins)Developmental Biology由于果蝇具有以上优点，近年来仍然被广泛用做分子发育生物学研究的模型。在其胚胎发育的梯度假说被证实后，已鉴定出了几个在卵子中形成梯度、调节细胞定位和分化并决定胚胎发育方式的成形因子；在位于卵子后极和种质(germplasm)中发现了为种系细胞导向的蛋白因子有趣的是，在1997和1998连续两年被科学杂志称为当年十大重要突破成就之一。关于调控生物昼夜节律生物钟基因的研究也多半是在果蝇中完成的(Bloom1998)。果蝇的基因组大约为180Mb，其常染色质部分约为120Mb。到2000年3月，常染色质部分的全部碱基序列已基本确定，其基因组大约编码13600个基因，在数量上比线虫还要少，但这些基因具有明显的功能多样性(Adamseta12000)。Developmental Biology第三节第三节 爪爪 蟾蟾一、爪蟾的分类地位及其作为模式生物的意义一、爪蟾的分类地位及其作为模式生物的意义爪蟾的全称为光滑爪蟾爪蟾的全称为光滑爪蟾(Xenopus laevis)，它属于脊椎动物，它属于脊椎动物两栖纲两栖纲(Amphibia)、无尾目、无尾目(Anura)、负子蟾科、负子蟾科(Pipidae)、爪蟾属爪蟾属(Xenopus)。因产于非洲，又名非洲爪蟾，现一般。因产于非洲，又名非洲爪蟾，现一般简称为爪蟾。简称为爪蟾。Developmental Biology负子蟾科学名：Xenopuslaevis属名：Xenopus食性：由于没有舌头只能利用其前肢搅食水中的无脊椎动物。人工饲养条件下，可以喂饲植物性饲料和动物性饲料，如动物肝脏和植物类的水藻。分布：由南非的热带草原起，北至肯尼亚，乌干达西至喀麦隆。人工饲养方面。Developmental Biology由于爪蟾是脊椎动物，与人类及其他经济动物具有更为密切的关系，其发育模型及调控机制与人类及其他高等动物更相似，且与其他两栖动物一样，具有较大的、易于观察分析的卵子，因而有关脊椎动物的卵子发生、体轴决定、受精激活、卵裂与中囊胚转换(midblastulatransition)、原肠形成、神经胚形成、器官发生、核移植及体细胞克隆等有关发育生物学原理和知识基本上都是来自于爪蟾这一模式动物和其他相关两栖动物的研究成果。正是在这些研究成果基础上的演绎、推断和扩展；构成了脊椎动物发育生物学的基本原型。因而，爪蟾是脊椎动物发育生物学研究中一爪蟾是脊椎动物发育生物学研究中一个最重要而又最典型的代表，是脊椎动物胚胎学和发个最重要而又最典型的代表，是脊椎动物胚胎学和发育生物学的奠基者。下育生物学的奠基者。下图是光滑爪蟾的生命周期示意图。Developmental BiologyDevelopmental Biology二、爪蟾及两栖动物作为模式生物的优点二、爪蟾及两栖动物作为模式生物的优点爪蟾作为模式动物除了其显著的科学意义外，同时也具有明显爪蟾作为模式动物除了其显著的科学意义外，同时也具有明显的优点。的优点。爪蟾生活在水中，成体约长爪蟾生活在水中，成体约长7 cm，易于在实验室人工养殖。，易于在实验室人工养殖。易于进行人工繁育，特别是通过注射促性腺激素，可以诱导易于进行人工繁育，特别是通过注射促性腺激素，可以诱导其在任何时候产卵。其在任何时候产卵。爪蟾的卵子较大，直径约为爪蟾的卵子较大，直径约为12 mm，且在体外受精、体，且在体外受精、体外发育，因而无需复杂昂贵的仪器，就可在实验室进行显微操外发育，因而无需复杂昂贵的仪器，就可在实验室进行显微操作等各种实验。作等各种实验。发育早期通过辐射状完全卵裂产生囊胚。其透明的卵壳可以发育早期通过辐射状完全卵裂产生囊胚。其透明的卵壳可以采用手术或化学方法脱去，从胚胎上切下来的细胞团可以依靠采用手术或化学方法脱去，从胚胎上切下来的细胞团可以依靠细胞中的卵黄提供营养，在无菌的生理盐水中继续发育。因而，细胞中的卵黄提供营养，在无菌的生理盐水中继续发育。因而，许多早期有关发育生物学的重大突破，如以胚胎学大师许多早期有关发育生物学的重大突破，如以胚胎学大师Hans Spemann为首的一批发育生物学开创者在为首的一批发育生物学开创者在20世纪世纪2030年代所年代所进行的胚胎分割实验和胚胎诱导实验，以及进行的胚胎分割实验和胚胎诱导实验，以及20世纪世纪5060年代年代Robert Brigg Thomas King和和John Gurdon等关于细胞核的多等关于细胞核的多能性能性(pluripotency)与体细胞克隆等著名实验，都是以爪蟾等两与体细胞克隆等著名实验，都是以爪蟾等两栖动物为研究材料完成的。我国的胚胎学及发育生物学研究也栖动物为研究材料完成的。我国的胚胎学及发育生物学研究也主要是以朱冼教授为首的一批学者以两栖动物中华大蟾蜍为实主要是以朱冼教授为首的一批学者以两栖动物中华大蟾蜍为实验材料开创起来的。验材料开创起来的。Developmental Biology三、热带爪蟾三、热带爪蟾光滑爪蟾的理想替身光滑爪蟾的理想替身由大量的染色体和核型分析工作证明，具有36个染色体的光滑爪蟾的基因组已发生了重复加倍，是古老的四倍体物种。在每个个体的基因组中，大多数基因不像二倍体动物那样只有2个拷贝，而具有4个拷贝，因而在这一模式动物中不可能进行类似于在果蝇、线虫和小鼠中进行的通过干扰一个基因功能或者剔除一个基因而观察到什么错误的遗传分析研究。近年来，一种源于西非雨林湿地的热带爪蟾热带爪蟾(Xenopus tropicalis)作为爪蟾属中惟一作为爪蟾属中惟一的二倍体物种，已受到发育生物学家和细胞生物学家的的二倍体物种，已受到发育生物学家和细胞生物学家的关注，已成为替代光滑爪蟾的理想模型。关注，已成为替代光滑爪蟾的理想模型。热带爪蟾除具有前述光滑爪蟾作为模式动物的优势外，与光滑爪蟾相比，热带爪蟾还具有几个独特的优势有几个独特的优势：Developmental Biology热带爪蟾为爪蟾属中惟一的二倍体物种，其单倍体基因热带爪蟾为爪蟾属中惟一的二倍体物种，其单倍体基因组只有组只有1.78pg或或1.71 09bp，近于光滑爪蟾，近于光滑爪蟾(3.2 pg或或3.11 09 bp)的一半，是基因组最小的两栖动物。与其他的一半，是基因组最小的两栖动物。与其他模式动物相比，他也具有明显的优势。其基因组近小鼠模式动物相比，他也具有明显的优势。其基因组近小鼠的一半，与斑马鱼的一半，与斑马鱼_(1.8109 bp)大小相近。大小相近。成熟的热带爪蟾比光滑爪蟾的个体要小得多，因而用成熟的热带爪蟾比光滑爪蟾的个体要小得多，因而用同等空间养殖的个体数要比养殖光滑爪蟾多得多同等空间养殖的个体数要比养殖光滑爪蟾多得多热带爪蟾的世代周期比光滑爪蟾热带爪蟾的世代周期比光滑爪蟾(12年年)也短得多，也短得多，一般为一般为46个月，且在优化的实验室条件下，还可进一个月，且在优化的实验室条件下，还可进一步缩短。步缩短。尽管其个体较小，但每次排卵仍能排出尽管其个体较小，但每次排卵仍能排出1 0003000粒粒卵子，其胚胎卵子，其胚胎(0.70.8mm)虽比光滑爪蟾虽比光滑爪蟾(1.01.3 mm)略小，但仍不妨碍进行精细的胚胎操作。略小，但仍不妨碍进行精细的胚胎操作。由于它是光滑爪蟾的亲缘种，两种间许多基因高度保由于它是光滑爪蟾的亲缘种，两种间许多基因高度保守，因而有关光滑爪蟾的研究资料可以直接应用于热带守，因而有关光滑爪蟾的研究资料可以直接应用于热带爪蟾。爪蟾。Developmental Biology热带爪蟾作为新的模式动物用于发育生物学研究还主要在于转基因技术的独特应用主要在于转基因技术的独特应用。该技术首先是将外源DNA在体外整合到分离的精核中，然后再将这些经遗传操作的精核注射到未受精卵中，而由此产生转基因胚胎。这种方法不但效率高，在几小时内能产生几百个转基因胚胎，而且效果好，由于转移基因在受精前已整入雄性配子基因组，因而形成的胚胎不是嵌合体，且无需再经过多代繁育去寻找和建立转基因纯系由于热带爪蟾具有作为模式动物的上述诸多优点，最近包括美国哈佛医学院的Amaya教授等在内的一批发育生物学家建议开展热带爪蟾的基因突变呈现研究，以分析控制不同发育阶段的基因。Developmental Biology第四节第四节 斑斑 马马 鱼鱼斑马鱼(zebrafish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼（Brachydaniorerio），原产于印度、孟加拉国。斑马鱼(B.rerio)，是淡水水族箱观赏鱼，原产於亚洲，体长约4公分(1.5吋)，具暗蓝与银色纵条纹，蓑鮋属鱼类是海水水族箱观赏鱼，鳍棘有剧毒，体具色彩丰富的垂直条纹。有些种类称为蓑鮋(lion-fish)或称狮子鱼、火鸡鱼。由于其基因与人类87%相似，因此广泛应用与生命科学的研究，2009年研究表面，它可能为盲人和耳聋带来福音。Developmental Biology一、斑马鱼作为模式生物的起因一、斑马鱼作为模式生物的起因果蝇和线虫作为无脊椎动物发育生物学研究的模式物种已开创了分子发育生物学研究的先河，奠定了分子发育生物学的基础。这2个物种之所以成为模型，主要原因在于它们能将胚胎学和遗传学有效地结合起来。利用这2个物种，研究者不仅能看见其发育过程中的胚胎，而且能有效地诱导胚胎突变，并能观察到其突变是如何扰乱正常发育的。然而20世纪90年代，在脊椎动物中还没有找到这样的模式物种。鼠类虽带动了现代高等遗传学(特别是基因转移方面)的发展，但其胚胎深埋于母体子宫中而无法进行胚胎学观察；爪蟾虽一直是胚胎学的好材料，但因繁育太慢而受到一定限制。因而，具有繁育力强、体外产卵、体外受精且胚体透明胚体透明等生殖特性的鱼类自然成为发育生物学家们珍爱的对象，特别是近十几年来由于一批分子生物学家把目光转向了鱼，鱼已在揭示生命本质及其运行机制的发育生物学基础研究领域占有愈来愈重要的地位。Developmental Biology快速的繁殖周期和高度的产卵能力快速的繁殖周期和高度的产卵能力，胚体胚体透明且发育速度快透明且发育速度快。认为斑马鱼完全具备认为斑马鱼完全具备作为脊椎动物分子发育生物学甚至人类基作为脊椎动物分子发育生物学甚至人类基因组计划模式种的条件，是理想的分子发因组计划模式种的条件，是理想的分子发育生物学研究的动物模型。育生物学研究的动物模型。Developmental Biology二、斑马鱼作为模式生物的原由二、斑马鱼作为模式生物的原由斑马鱼起源于印度和巴基斯坦，为小型的热带鱼类。其染色体数为50。成体长34cm，孵出后约3个月可达性成熟。成熟的雌鱼每隔一周可产几百粒卵子，卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，在2531之间发育正常。胚体完全透明，使得研究者不仅能跟踪观察每一个细胞的发育命运，而且也可观察到像原肠期的细胞运动、脑区的形成和心跳等胚胎发育事件(Wilsoneta11993)。斑马鱼个体小，养殖花费少，能大规模繁育。据估算，在一个大的斑马鱼遗传学实验室，一尾鱼培育并保养一年，其耗费不到3美元，在此期间，它能产出几千个胚胎。此外，斑马鱼的精子还可通过冷冻来保存，给遗传操作和人工诱变提供了极为有利的条件，加之胚体透明，发育异常的突变体很容易被鉴定出来。由于这些原因，斑马鱼很快成为分子发育生物学家和遗传学家开展科学研究的宠物。Developmental Biology生命周期短，孵出后约生命周期短，孵出后约3个月可达性成熟，个月可达性成熟，繁殖快。繁殖快。产卵多，卵子体外受精，体外发育，胚胎产卵多，卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体完全透明，使得发育同步且速度快，胚体完全透明，使得研究者不仅能跟踪观察每一个细胞的发育研究者不仅能跟踪观察每一个细胞的发育命运，而且也可观察到像原肠期的细胞运命运，而且也可观察到像原肠期的细胞运动、脑区的形成和心跳等胚胎发育事件。动、脑区的形成和心跳等胚胎发育事件。斑马鱼个体小，养殖花费少，能大规模繁斑马鱼个体小，养殖花费少，能大规模繁育。育。Developmental Biology三、斑马鱼作为模式生物的特点及其应用三、斑马鱼作为模式生物的特点及其应用1细胞谱系分析的优势材料细胞谱系分析的优势材料细胞命运的追踪细胞命运的追踪发育生物学的主要研究方法之一是细胞谱系分析。发育生物学的主要研究方法之一是细胞谱系分析。细胞谱系分析通过记录特定细胞在胚胎发育中细胞谱系分析通过记录特定细胞在胚胎发育中的分裂历史，来揭示其特定的细胞发育命运，并的分裂历史，来揭示其特定的细胞发育命运，并观察其发育潜能。斑马鱼由于胚胎发育前期细胞观察其发育潜能。斑马鱼由于胚胎发育前期细胞分裂速度快、胚体透明、特定的细胞类型易于识分裂速度快、胚体透明、特定的细胞类型易于识别等有利因素，很快成为脊椎动物中最适于进行别等有利因素，很快成为脊椎动物中最适于进行细胞谱系分析的物种。细胞谱系分析的物种。用来进行斑马鱼细胞谱系分析的方法有用来进行斑马鱼细胞谱系分析的方法有3种，即直种，即直接观察法、遗传嵌合克隆分析法和颜料示踪分析接观察法、遗传嵌合克隆分析法和颜料示踪分析法。这些方面的早期工作主要由俄勒冈大学斑马法。这些方面的早期工作主要由俄勒冈大学斑马鱼研究中心的鱼研究中心的Kimmel，Warga和其合作者们完成。和其合作者们完成。斑马鱼的细胞谱系分析和细胞发育命运追踪已开斑马鱼的细胞谱系分析和细胞发育命运追踪已开始应用于组织器官的起源研究。始应用于组织器官的起源研究。Developmental Biology2酵母式的单倍体发育潜能酵母式的单倍体发育潜能省时诀窍省时诀窍椎动物二倍体基因组分析的耗时性是发育生物学家和遗传学家头痛的难题，当杂合体动物产生后，必须耗费几个月甚至几年的时间来培育其F1代，然后再经多代的同胞交配来发掘出纯合的隐性突变体，才能揭示其表型特征。由Streisinger等(1981)在斑马鱼中创立的单倍体和二倍体雌核发育技术克服了这一难题。紫外照射失活的精子能用来受精卵子并能诱导单倍体发育。单倍体胚胎可发育出基本的体型；但表现有包括短尾、脊椎弯曲和水肿等多种畸形，并在受精后4d左右死亡。单倍体胚胎可用来甄别影响基本体型的突变，但不能用于仔细的筛选，因为即使野生型的单倍体胚胎在很多结构中及后期发育进程中也有异常出现。然而，将紫外线照射失活的精子与卵子受精后再采用静水压休克或热休克诱导第二极体保留或抑制第一次卵裂的方法可获得杂合的或纯合的雌核发育二倍体杂合的或纯合的雌核发育二倍体，且这些二倍体都可存活并可育。这样，一些隐性突变仅需一代或两三代就可得到鉴定。由于斑马鱼繁育一代仅需3个月左右，因此隐性突变很快就能鉴别出来，从而大大缩短了时间隐性突变很快就能鉴别出来，从而大大缩短了时间。Developmental Biology3果蝇式的人工突变途径果蝇式的人工突变途径饱和诱变饱和诱变 。饱和诱变方案是20世纪80年代初在果蝇中开创的，它使得果蝇很快成为发育生物学研究的焦点。饱和诱变的基本原理是饱和诱变的基本原理是用化学诱变剂处理成熟的雄性个体，然后将其诱变了的精子用化学诱变剂处理成熟的雄性个体，然后将其诱变了的精子与卵子受精，产生的个体通过三代繁育来筛选发育异常的胚与卵子受精，产生的个体通过三代繁育来筛选发育异常的胚胎胎。因为发育通道由一系列的分子事件控制，要想解析完整的发育过程，必须碰巧遇上影响每一系列事件的全部基因或几乎所有的基因。反过来说，这必须呈现大量的动物个体才可得到筛选。迄今，这样的呈现筛选在脊椎动物中被认为是不可能的。在小鼠中，虽可获得数以百计的繁育纯系，但由于胚胎在子宫中发育，胚胎期受到影响的突变体无法呈现，因而限制了其研究范围。斑马鱼卵子体外受精和胚胎体外发育的生殖特征避开了这一难题，饱和诱变的工作量是繁重的。首先要建立起可容纳近百万尾鱼的养育设施；其次要寻找出有效的诱变剂和最佳的诱变参数；第三是突变体的呈现和筛选；最后是突变体表型的鉴定及其控制基因的寻觅和克隆分析。Developmental Biology4小鼠式的遗传操作特点小鼠式的遗传操作特点基因转移基因转移与小鼠中发达的基因转移研究相比，斑马鱼的基因转移分析虽处于摇篮阶段，但进展是令人鼓舞的。最近，来自于麻省理工学院和加州大学圣迭戈分校的一批学者在发现了一种拟形的还原病毒载体能有效感染培养的鱼类细胞的基础上，发展了一条通过该拟形还原病毒载体进行基因转移的新路线。这种拟形病毒含有鼠类MoMLV(莫洛尼氏白血病毒)的基因组，其外壳中的env糖蛋白完全由VSV(水泡性口膜炎病毒)中的糖蛋白(G蛋白)所替代。由于存在VSV的G蛋白，这一拟形病毒因而具有很广的寄主范围，一旦进入细胞，即可将还原病毒序列整合到寄主的基因组中。前不久，他们将这种病毒注射到51个斑马鱼的囊胚期胚胎中，发现8尾鱼已将这一原病毒的DNA传给了下一代，并按孟德尔方式遗传。这些起步性的结果表明，适于鼠类的还原这些起步性的结果表明，适于鼠类的还原病毒载体基因转移技术同样适用于斑马鱼，这种小鼠式的病毒载体基因转移技术同样适用于斑马鱼，这种小鼠式的遗传操作特点必将大大加快对斑马鱼的研究，有利于阐明遗传操作特点必将大大加快对斑马鱼的研究，有利于阐明控制脊椎动物发育的机制。迄今，斑马鱼卵母细胞体外成控制脊椎动物发育的机制。迄今，斑马鱼卵母细胞体外成熟、配子发生和受精的调控机制、胚胎干细胞的分离和克熟、配子发生和受精的调控机制、胚胎干细胞的分离和克隆及基因剔除隆及基因剔除(gene knockout)研究尚处于探索之中，预研究尚处于探索之中，预计不久将会产生突破。计不久将会产生突破。Developmental Biology5基因连锁图的构建基因连锁图的构建基因克隆定位基因克隆定位要想鉴定和克隆引起这些突变表型的基因并分析它们的正常功能，首要的条件是必须构建斑马鱼的基因连锁图构建斑马鱼的基因连锁图，然然后在已知标记的基础上，才有可能去克隆和分析新的基因。后在已知标记的基础上，才有可能去克隆和分析新的基因。为了这一目的，俄勒冈大学的Postlethwait等依据在植物基因组分析中发展起来的RAPD(randomlyamphfiedpoly而orphicDNA)方法，利用斑马鱼可进行单倍体和二倍体雌核发育的有利条件，以斑马鱼的2个品系：AB和Darjeeling为材料，鉴定了402个RAPD顺序和13个SSR(simplesequencerepeat)，并且检验了它们在一尾ABDarjeel一ng雌性杂合体的94个单倍体后代中的分离规律，从而构建了斑马鱼基因组的第一个连锁图(Postlethwait1994)。在此基础上，Postlethwait等进一步扩展了基因型单倍体胚胎的分析能力，已将一隐性的色素突变基因(黄铜色)定位到了连锁图上。Developmental Biology第五节小第五节小 鼠鼠一、小鼠的基本特性及实验小鼠的发展一、小鼠的基本特性及实验小鼠的发展小鼠(Musmusculus)是啮齿目(Rodentia)、鼠科(Muridae)的一种哺乳动物。由于其易于繁殖和饲养，具有较为价廉和方便操作的优点，因而从20世纪初开始，随着遗传学、胚胎学、营养学、发育生物学和生物医学的兴起，小鼠作为实验动物得到广泛的应用和发展。迄今，使用小鼠的研究者不但可获得详尽的有关小鼠使用、繁殖，管理及防病等各方面的文献资料，而且在多年远交、近交等遗传筛选的基础上，已拥有大量遗传背景不同的品系，因而研究者可依据研究目的，选取用于实验研究所需的理想品系。Developmental Biology小白鼠是野生鼷鼠的变种，属于动物界，脊椎动物门，哺乳纲，啮齿目，鼠种。我国目前饲养最广泛的是1946年从印度某研究所引入到云南昆明饲养的品种，又名昆明种。50年代由昆明引到北京生物制品研究所，以后输送到全国各地饲养。Developmental Biology大鼠（Rat；Rattusnorregicus）鼠科(Muridae)多种啮齿动物的统称，常指本科多种不相关物种，尤指鼠属(Rattus，约80种，遍布旧大陆)。似小鼠而体形较大。英文rat也指称常鼠科之其他属乃至其他科的动物。马来西亚的黑鼠(又称家鼠；Rattusrattus)和中国的褐鼠(又称沟鼠，或挪威鼠；Rattusnorvegicus)已随人类活动散布到世界各地。这两个种均可将疾病传播给人类，如腺鼠疫可由黑家鼠身上的蚤传播。实验室用的大白鼠是褐家鼠的白化变种。Developmental Biology按遗传学的划分标准，现今保持和使用的实验小鼠可分为远交群远交群(outbred stook)、近交系、近交系(inbred strain)和同源基因和同源基因导入系导入系(congenic strain)等等。所谓远交群，指的是那些为了保持群体内相对稳定的遗传多样性而通过随机交配所获得的繁育群体。所谓近交系，指的是那些连续进行20代以上的兄弟X姐妹交配所获得的具有相同遗传背景的近交群体或具有同等遗传相似性的人工繁育群体。同源基因导入系是指通过一系列回交方法把一个突变基因导入到一个近交系而形成的人工繁育群体。在养育条件和环境要求方面，实验小鼠也有其严格的生态学标准。现一般将经剖腹产后饲养在完全无菌隔离器内、未感染任何菌的小鼠称为无菌小鼠，感染有一种已知非致病菌的小鼠称为悉生小鼠，感染有一种或多种致病菌的称为已知菌小鼠；将无菌小鼠或悉生小鼠从隔离器中取出后放在某种特殊设施或层流架屏障系统内饲养的小鼠称为屏障系统饲养小鼠；而放在安全性较低的屏障系统内饲养的小鼠则称为受监测小鼠；最后一级的普通小鼠是指饲养在普通环境中、携带有多种未知菌的小鼠。Developmental Biology二、小鼠作为发育生物学研究模型二、小鼠作为发育生物学研究模型的优点的优点哺乳动物的胚胎发育机制不但要比低等脊椎动物复杂得多，而且其研究过程也比低等脊椎动物困难得多。就实验操作过程来说，只有早期胚胎可从输卵管里冲出，一旦着床后，必须进行手术，且胚胎不易在实验室作较长时间保存。尽管存在许多困难和不便，但要想揭示包括人类在内这一大批高等脊椎动物的发育奥秘，必需要在哺乳动物中找到理想的研究模型。小鼠就是因为具备一般实验动物快繁、多仔等优势特点，而成为发育生物学研究的理想模型。Developmental Biology1小鼠的繁殖不受季节影响。小鼠的繁殖不受季节影响。出生后6周的小鼠达到性成熟，其排卵周期很短，每4d一次，每次可排出812个已排出第一极体、完成了第一次减数分裂的成熟卵子。由于小鼠每次交配有812个成熟卵子受精，因此从理论上来说，每窝可产出812只幼鼠。加上性成熟小鼠一年可多次连续交配受孕，每年产仔次数可多达8窝。2。为受精卵和着床前囊胚的获得，转基因的应用，突变体的。