流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化 (1).pdf

作者单位:1 云 南沃森生物 技术有限公 司研发中 心(昆明650118);2 华中师范大学生命科学学院 昆虫学研究所(武汉 430074).通讯作者:代云波,E-mail:中国图书分类号 R37311+3 文献标识码 A 文章编号 1004-5503(2008)01-036-04=预防制品流感裂解疫苗纯化及裂解工艺的优化杨1 刘红岩1 马波1 郭仁1 彭建新2 谢飞1 侯峰1 代云波1=摘要 目的 优化大规模生产的流感病毒裂解疫苗的纯化及裂解工艺。方法 比较凝胶层析和蔗糖密度梯度超速离心的纯化效果,以及 Triton X-100和去氧胆酸钠两种裂解剂在不同条件下的裂解效果。结果 层析法纯度稍高于蔗糖密度梯度超速离心法,而蔗糖密度区带超速离心法的收率优于层析法。Triton X-100 的裂解效果优于去氧胆酸钠,裂解剂浓度为0.5%或0.8%,裂解 3 或 4 h,裂解率达 90%以上。疫苗在 4e 保存 1年后,所有检测项目均合格,4e 保存 18 个月和 37e 保存28 d后,HA 含量仍保持在 30Lg/ml以上。结论 已建立了切实可行的流感病毒裂解疫苗规模生产的纯化及裂解工艺。=关键词 流感裂解疫苗;纯化;裂解Optimization of Procedure for Purification and Lysis of Influenza Virus VaccineYANG Zhev,LIU Hong-yan,MA Bo,et al(vWalvax BioTech Co.Ltd,Kunming 650018,China)=Abstract Objective To optimize the procedure for purification and lysis of influenza virus vaccine.Methods Compare the purificationefficacies by gel filtration chromatography and by sucrose density gradient centrifutgation,as well as the lysis efficacies withTriton X-100 andwithsodium deoxycholate under various conditions.Results The purity of split influenza vaccine after purification by gel filtration chromatography wasslightly higher than that by sucrose density gradient ultracentrifugation,while the recovery of vaccine by the latter was higher than that by the for-mer.Triton X-100 showed good lysis efficacy as compared with sodium deoxycholate.After lysis with Triton X-100 at a final concentration of0.5%or 0.8%for 3 or 4 h,more than 90%of influenza vaccine was lyzed.After storage at 4efor 12months,allthe quality indexes of thepurified vaccine met the relevant requirements.However,after storage at 4e for 18 months or at 37e for 28 d,the HA content of vaccine wasstill more than 30 Lg/ml.Conclusion A practical and feasible procedure for purification and lysis of influenza vaccine was developed.=Key words Split influenza virus vaccine;Purification;Lysis 本文根据WHO 规程有关规定和5中国药典6三部(2005 版)相关规定,并参阅文献,对流感疫苗裂解病毒抗原超速密度区带离心及凝胶层析纯化病毒的具体方法进行了优化,建立了有效的规模化生产疫苗的裂解和纯化工艺。11 材料与方法111 鸡胚种子批制备使用 9 11 日龄 SPF 鸡胚,来自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;疫苗制备使用封闭饲养健康鸡群的 9 11 日龄鸡胚,来自昆明实验养鸡场。112 病毒3 个流行性感冒病毒毒种来自 NIBSC,具有完整的历史和质量背景资料。即H1N1 A/New Caledonia/20/99(简称 A1)、H3N2 A/New York/55/2004(简称A3)和 B/JiangSu/10/2003株(简称 B)。113 试剂及仪器Serazym Ovalbumin ELISA 试剂盒购自Seramun D-iagnostica GmbH;牛血清白蛋白标准品购自中国药品生物制品检定所;蛋白纯化仪AKTA explorer100 为 Phar-macia 产品;介质Sepharose 4 FF 为Pharmacia 产品。114 病毒培养及纯化取工作种子,以稀释度 10-3接种于11 日龄的普通鸡胚,经 35e 培养 72 h 后,置 4e 冷胚过夜,收获尿囊液。分别对不同批次的尿囊液进行检测,将无菌试验、灭活试验合格且血凝滴度大于 1B240 的尿囊液合并;将单型病毒原液经10 L m 粗滤后,再经3、0.45 和 0.22 L m 膜过滤,最后用相对分子质量为300 000的 膜 包 进 行 约 50 倍 超 滤 浓 缩,再 经Sepharose 4FF 凝胶层析纯化或蔗糖密度区带超速离心纯化。114.1 Sepharose 4FF 凝胶层析:以 0101 mol/L PBS(pH7.4)为平衡缓冲液;0101 mol/L PBS(pH7.4)为洗脱缓冲液;流速 1.0 ml/min;病毒液经层析纯化后,收集洗脱峰,用直接血凝法检测效价。#36#中国生物制品学杂志 2008 年1 月第 21 卷第 1期 Chin J Biologicals January 2008,Vo1.21 No.1 114.2 蔗糖密度梯度超速离心:蔗糖浓度 30%55%,离心条件 25 000 r/min,8 h。以核酸蛋白检测仪描记样品在 280 nm 处的吸收曲线,病毒液经离心后,直接血凝法检测效价,根据血凝滴度收集目的峰。115 病毒裂解将血凝效价为 1B2 560 的纯化病毒液分别加入Triton X-100 和去氧胆酸钠,获得浓度分别为 0.2%、0.5%和 0.8%的裂解溶液,于 1、2、3 和 4 h 分别取样,电镜观察病毒裂解效果。116 卵清蛋白含量测定采用ELISA 双抗体夹心法,使用Serazym Ovalbu-min ELISA 试剂盒进行检测。117 血凝素含量测定采用免疫单扩散法1。将 100 Ll 抗体(NIBSC)加入到 1.5%、56e 的琼脂糖中,打孔,每孔直径为3 mm,每孔边距为 6 mm。将待检样品、标准品(NIB-SC)及对照品(NIBSC)室温裂解 40 min,每孔加入样品15 Ll,扩散 24 h,PBS 浸泡,晾干,考马斯亮蓝染色,脱色后观察结果。118 纯度测定采用HPLC 法。119 总蛋白测定采用 Lowry 法。1110 内毒素测定采用鲎试剂法。1111 稳定性试验疫苗于4e 保存 1 年后,测定其各项指标。于37e 保存 7、14、21、28 d,于 4e 保存 3、6、9、12、15、18个月,分别测定各型HA含量。21 结果211 病毒液纯化效果211.1 Sepharose 4FF 凝胶层析:收集洗脱峰 1、2,经血凝滴度和鉴别试验,确认病毒集中在峰1,见图 1。211.2 蔗糖密度梯度超速离心:收集洗脱峰1、2、3,经血凝滴度和鉴别试验,确认病毒集中在峰 2 中,见图2。第 1 峰为鸡胚卵清蛋白及小分子杂蛋白颗粒,第 2 峰为有结构的病毒颗粒,第 3峰为大分子杂蛋白,电镜下未见流感病毒颗粒。211.3 病毒液的纯度:高效液相色谱显示,出现完整的一个峰,未见其他杂蛋白峰,在出样末端有微小波,计算病毒液纯度可达 85%以上。211.4 病毒液回收率:检测结果表明,不同方法纯化病毒后,鸡卵清蛋白和流感病毒峰分离效果显著,纯化效果较好。纯化前卵清蛋白含量为 25.5 L g/ml,凝胶层析和蔗糖密度梯度离心纯化后分别为 0.11和 0128 L g/ml,其去除率分别为 9915%和 9715%。蔗糖密度梯度离心和凝胶层析法的回收率分别为4210%和 3817%,见表 1。图 1 流感病毒 Sepharose 4FF凝胶层析图谱Fig11 Sepharose 4FF chromatographic profile of influenzavirus图 2 流感病毒蔗糖密度梯度超速离心图谱Fig 21 Sucrose density gradient ultracentrifugation profileof influenza virus212 不同裂解剂浓度和裂解时间的裂解效果比较A1、A3 和 B 株病毒纯化液在不同浓度裂解剂、不同裂解时间的HA 抗原含量和HA 裂解收率检测结果表明,Triton X-100 的裂解效果优于去氧胆酸钠。应用 Triton X-100,裂解剂终浓度为 0.5%或018%,裂解3或 4h 时,3 个型别病毒液裂解HA 收获率均达到了最高值(90%);不同型别病毒、裂解剂浓度和裂解时间的裂解效果大致相同,见表 2和表 3。以 5 个视野中完整病毒与 0 浓度中完整病毒个数的比例为判定标准,从电镜照片可见,裂解前均为完整病毒,见图 3,裂解后的视野内基本无完整病毒,见图 4,表明使用Triton X-100 裂解能达到预期效#37#中国生物制品学杂志2008 年 1月第 21卷第 1 期 Chin J Biologicals January 2008,Vol.21 No.1 果。213 疫苗稳定性6 批成品 4e 保存 1年后,所有检测项目检定结果均符合5中国药典6三部(2005 版)要求,除 HA 含量略有下降外,其他项目均无明显变化,见表 4。图 3 流感病毒裂解前电镜照片Fig 31 Electron microscopy of whole influenza virus疫苗在 37e 保存 7、14、21、28 d 后,其 HA 含量逐步下降,但仍保持在 30 L g/ml 以上。在 4e 保存 3、6、9、12、15、18 个月,HA 含量缓慢下降,但也未低于30 L g/ml的合格标准,见表 5。图 4 流感病毒裂解(Triton X-100)后电镜照片Fig41 Electron microscopy of lyzed influenza virus表 1 病毒液纯化结果Tab 11 Purification of influenza virusProcedureConcentrated sampleHA(Lg/ml)Ovalbumin(Lg/ml)HAContent(Lg/ml)Recovery(%)OvalbuminContent(Lg/ml)Removalrate(%)Purity(%)Sepharose 4FF chromatography86025.537438.70.1199.591.5Sucrose density gradientultracentrifugation86025.541942.00.2897.586.9表 2 Triton X-100裂解试验Tab 21 Determination of HA content by Triton X-100 lysis testVirusTritonX-100(%)1 hHA(Lg/ml)Recovery(%)2 hHA(Lg/ml)Recovery(%)3 hHA(Lg/ml)Recovery(%)4 hHA(Lg/ml)Recovery(%)A10.279.344.293.257.4118.583.6130.888.50.598.759.8107.670.4138.191.5155.794.40.8110.567.1120.468.7145.793.1154.395.8A30.283.541.8103.260.2123.879.6133.487.40.592.748.7121.670.8157.190.2170.392.10.899.648.9128.374.1160.294.5168.794.7B0.277.247.699.662.1125.285.7138.789.40.5108.561.5110.573.2147.790.8163.890.90.8110.356.2107.672.6168.292.4172.593.7表 3 去氧胆酸钠裂解试验Tab 31 Determination of HA content by deoxycholate lysis testVirusSodiumdeoxycholate(%)1 hHA(Lg/ml)Recovery(%)2 hHA(Lg/ml)Recovery(%)3 hHA(Lg/ml)Recovery(%)4 hHA(Lg/ml)Recovery(%)A10.266.428.982.654.397.168.4126.681.40.582.740.893.766.4107.681.7148.288.10.883.961.7106.469.8123.884.2149.890.6A30.257.638.287.258.7101.475.4118.784.20.569.144.798.667.3131.882.7137.387.90.878.646.5108.769.1147.986.9156.991.5B0.264.235.786.457.1105.470.3128.484.80.575.850.8102.267.4132.982.7147.589.10.888.362.3108.171.8159.787.1163.792.2#38#中国生物制品学杂志 2008 年1 月第 21 卷第 1期 Chin J Biologicals January 2008,Vo1.21 No.1 表 4 疫苗 4e 保存 1 年的各项稳定结果Tab 41 Stability of final product after storage at 4efor 12 monthsIndexStrainBefore storageSepharose 4FFSucrose densitySucrose densitygradient centrifugationHA(Lg/ml)A136?130?230?2A349?232?133?2B37?134?132?1Sterility test-Pyrogen test-Identity testPassPassPassTotal proteins(Lg/ml)189?5 164?4 173?7 Formaldehyde(Lg/ml)20?117?113?2Merthiolate(Lg/ml)75?372?268?4Ovalbumin(Lg/ml)0.35?0.070.22?0.070.31?0.05SafetyPassPassPasspH7.1?0.57.2?0.47.1?0.5AppearancePassPassPassVolumePassPassPass表 5 疫苗 4e 和 37e 保存不同时间的稳定性Tab 51 Stability of final product after storage at 4eand 37eProcedureStrainBeforestorageHA content(Lg/ml)after storage at 37e7 d14 d21 d28 dHA content(Lg/ml)after storage at 4e3 m6 m9 m12 m15 m18 mSepharoseA136?135?235?134?133?135?135?234?331?131?230?14FFA349?237?135?233?133?337?135?335?232?132?232?3B37?134?234?133?331?235?134?233?332?232?331?3Sucrose density gradientA136?135?135?234?333?235?335?134?331?131?230?1centrifugationA349?237?135?333?333?237?135?135?132?232?232?1B37?134?234?133?331?335?234?233?132?232?131?231 讨论WHO 每年根据全球流感病毒监测的分析推荐下一年度的3 型疫苗组分,以应对病毒的变异性 2。流感灭活疫苗能有效地保护 60%90%的健康人群。当前批准使用的流感病毒裂解疫苗的主要免疫原性组分是通过有机溶剂抽提纯化的HA,其含量至少在 30 L g/ml/株以上才能够提供足够的抗原以刺激免疫反应。目前世界上有 20 多个国家生产流感裂解疫苗或亚单位疫苗。流感病毒纯化主要有两种方法,即超速区带离心法和凝胶层析法。从本实验结果可以看出,两种方法均可以获得较好的纯度和收率。从产业化的角度考虑,密度梯度离心法的病毒回收率要优于凝胶层析法,但纯度不如凝胶层析法。这个问题可以通过减少梯度离心的中后部收样来调整。梯度离心结果显示各相对分子质量颗粒分离得较明显,有效峰为一个独立峰,未与杂蛋白峰交叉。裂解剂选择的原则是3,4:必须是已经运用于生物制品或药品生产的试剂;不能具有较高毒性;必须具有有效溶解流感病毒膜抗原的能力,收获率不能低于 70%。通过实验及中试生产验证,Triton X-100裂解流感病毒时HA 抗原的收获率超过80%,最高能达到 95%。但在浓度高于 1.0%,裂解时间超过 90 min 后,在病毒裂解的同时,部分血凝素发生了断裂,影响疫苗抗原性,因此选择 90 min作为裂解时间,1.0%作为裂解浓度。通过研究发现,在相同浓度和时间,Triton X-100 的裂解效果优于去氧胆酸钠。将裂解疫苗放置 4e、37e 的不同时间进行检测,HA 含量缓步下降,但均保持在 30 L g/ml 以上,表明该疫苗是稳定有效的。参考文献 1Wiliams MS,Mayner RE,Daniel NJ,et al.New developments inthe mea-surement of haemagglutinin content of influenza virus vaccines by single-radia-l immunodiffusion.J Biol Stand,1980,8:289-296.2Gerdil C.The annual production cycle for influenza vaccine.Vaccine,2003,21(16):1776-1779.3 Warburton MF.Desoxycholste-split influenza vaccine.Bull World HealthOrgan,1969,41(3):639-641.4 Gross PA,Ennis FA,Gaerlan PF,et al.Comparison of new triton X-100and tween-ether-treated spli-t treated vaccines in children.J Clin Microb-iol,1981,14(5):534-538.(收稿日期:2007-05-23)#39#中国生物制品学杂志2008 年 1月第 21卷第 1 期 Chin J Biologicals January 2008,Vol.21 No.1