添加复合菌剂好氧发酵牛粪生产生物肥料的工艺优化.pdf

第 25 卷 第 1 期农 业 工 程 学 报Vol.25No.12009 年1 月Transactions of the CSAEJan.2009189添加复合菌剂好氧发酵牛粪生产生物肥料的工艺优化曹慧玲1，王 琦2，胡青平1，陈五岭1（1西北大学生命科学学院，西安 710069；2中科院青岛生物能源与过程研究所，青岛 266101）摘要：以新鲜牛粪和稻壳粉为发酵原料，进行牛粪好氧发酵试验，探讨生物有机肥生产的最佳工艺条件。首先选择复合微生物菌剂接种量、原料含水率、C/N比、翻堆次数4个因素进行单因素试验研究，初步确定四个因素的最适范围，然后对四个因素进行正交优化试验，确定最佳发酵工艺参数。在一次发酵结束后，加入固氮细菌、解磷细菌和解钾细菌等有益微生物，通过测定二次发酵过程中有益微生物的变化情况，确定二次发酵终止时间。试验结果表明，一次发酵的最优工艺参数为原料含水率65%，C/N 301，菌剂接种量3.5，翻堆次数4 d一次。在一次发酵15 d后加入固氮细菌、解磷细菌和解钾细菌等有益微生物，发酵6 d，三种菌的活菌数达到稳定，可终止发酵。在此工艺条件下，物料升温快，最高温度高，高温持续时间长，腐熟度高，发酵周期缩短，生物有机肥中活菌数达到5.2 109cfu/g，发芽指数为96.8%。关键词：牛粪，好氧发酵，生物有机肥，复合微生物菌剂中图分类号：X713文献标识码：A文章编号：1002-6819(2009)-1-0189-05曹慧玲，王琦，胡青平，等.添加复合菌剂好氧发酵牛粪生产生物肥料的工艺优化J.农业工程学报，2009，25(1)：189193.Cao Huiling,Wang Qi,Hu Qingping,et al.Optimized technology for aerobic fermentation of dairy manure to produce bioorganicfertilizer by inoculating compound microbesJ.Transactions of the CSAE,2009,25(1)：189193.(in Chinese with Englishabstract)0引言随着集约化牧场的建立，畜禽粪便的产生量与日俱增，据统计1，2003 年中国畜禽粪便产生量约为 31.9 亿t，远超过当年工业固体废弃物 10 亿 t 的总量，畜禽粪便已成为城郊及农村环境污染的主要来源，不但危害生态环境及人类健康，还影响到畜禽产业的可持续发展。但从资源利用的角度分析，畜禽粪便以有机质为主，并含有一定量的氮、磷、钾、钙、镁、硫及各种微量元素等营养成分，经过处理，可以成为很好的农业肥料2。好氧发酵是目前最常用的无害化及资源化处理畜禽粪便的有效方法。发酵过程中，在微生物的降解作用下，不但可以生成大量可被植物吸收利用的有效态氮、磷、钾化合物，同时又能合成新的高分子有机物 腐殖质，它是构成土壤肥力的重要活性物质3,4。然而，传统的自然发酵由于所含土著微生物的种类和数量有限，以及发酵工艺条件的限制，存在着发酵周期长，发酵产品的肥效低，对环境造成二次污染等问题，限制了其大规模应用。目前，通过向物料中接种外源微生物菌剂以提高发酵效率的研究已有大量报道5-7，但关于牛粪好氧发酵的工艺参数优化方面的研究仍然少见报道。本研究通过单因素试验和正交优化试验对一次发酵的主要工艺参数进行了优收稿日期：2008-05-09修订日期：2008-09-07作者简介：曹慧玲（1978），女，山东人，硕士，主要从事固体废弃物处理及资源化利用研究。西安西北大学生命科学学院，710069。Email:通讯作者：陈五岭（1954），男，汉中人，教授，博士生导师。主要从事应用微生物研究。西安西北大学生命科学学院，710069。Email:化，还采用了二次发酵工艺。在二次发酵中添加的解磷细菌能够溶解土壤中难溶的磷酸三钙、磷酸铁等磷酸盐而释放出水溶性磷，供植物生长利用。解钾细菌（硅酸盐细菌）能分解由硅酸盐和铝硅酸盐组成的矿物质，释放出可供植物生长直接利用的磷、钾、硅等元素。同时，固氮芽孢杆菌也有较强的固氮能力。在二次发酵中加入大量复合有益微生物的目的是通过它们在土壤中的积极活动来提供作物需要的营养物质或产生激素来刺激作物生长，提高土壤肥力。因此，本研究以工业化生产生物有机肥为目的，采用二次发酵工艺，在发酵的不同阶段添加不同的复合微生物菌剂，对发酵过程中的主要工艺参数进行优化，探讨最优发酵工艺条件，达到提高发酵效率和发酵产品质量的目的，以期为牛粪的大规模处理以及为生物有机肥的生产提供必要的工艺参数和一定的理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1发酵原料以新鲜牛粪和稻壳粉为发酵原料，原料的主要理化性质见表 1。表 1原料的主要理化性质Table 1Main physical and chemical characteristics of compostmaterial原料含水率/%pH 值有机质/%C/N全碳/%全氮/%牛粪888.362.918.837.82.03稻壳粉107.272.369.542.30.61从原料角度出发，好氧发酵原料要求具有丰富的营190农业工程学报2009 年养物质，合适的 C/N 及适宜的含水率等。本研究选用稻壳粉作为辅料，并辅以少量的尿素或木屑调节，主要用于调节原料的含水率和 C/N。1.1.2一次发酵用复合微生物菌剂的制备将绿色木霉（Trichoderma viride）、米曲霉（Aspergillusoryzae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和假单胞菌（Pseudomonas sp.）分别在相应的培养基上扩大培养，具体步骤：用无菌生理盐水洗涤保存斜面，至无菌三角瓶中摇匀即成菌悬液；接种菌悬液于种子瓶，细菌在30，180 rpm条件下培养 12 h得到种子液，霉菌在 30，220 rpm 条件下培养 48 h 得到种子液；将 10%的种子液接种到发酵瓶中扩大培养 48 h 得到发酵液。分别将各菌株的发酵液与灭菌麸皮按 11 的比例混合发酵 2472 h后晾干，制成固体菌剂。将制备的固体菌剂按米曲霉绿色木霉枯草芽孢杆菌假单胞菌为 2211 的比例混合均匀，制成复合菌剂。1.1.3二次发酵用复合微生物菌剂的制备将 固 氮 细 菌 圆 褐 固 氮 菌（Azotobacterchroococcum）、解磷细菌 巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium）和解钾细菌 胶冻样芽孢杆菌（Bacillusmucilaginosus）分别用相应的液体培养基在 30，160 rpm条件下培养，待发酵液菌体达 1081010cfu/L 时，将其分别以 11 的比例接种于灭菌麸皮中，发酵 48 h 后晾干，制成固体菌剂。将制备的固体菌剂按圆褐固氮菌巨大芽孢杆菌胶质芽孢杆菌为 111 的比例混合均匀，制成复合菌剂。1.2一次发酵试验设计在活动板房的储槽内将原料堆成长 2 m、宽 1 m、高0.8 m 的条垛进行静态发酵。采用翻堆方式通风供氧，选择复合微生物菌剂接种量、原料含水率、C/N 比和翻堆次数四个因素进行单因素试验研究。本研究以温度和发芽指数作为评价指标，初步确定四个因素的最适范围，然后对四个因素进行正交优化试验，确定最佳发酵工艺参数，并确定一次发酵的时间。环境温度为 30左右。1.2.1单因素试验1）含水率对发酵的影响将牛粪与稻壳粉按一定比例混合均匀，含水率设四个水平，分别为50%，60%，70%，80%，添加尿素或木屑，调整原料的C/N为301，复合微生物菌剂的接种量为3，2 d翻堆一次，发酵周期20 d。2）C/N对发酵的影响将牛粪与稻壳粉按309的比例混合均匀，含水率为70%，通过添加尿素（C/N为0.43）调整C/N，原料的C/N设两个水平，分别为301和401，复合微生物菌剂的接种量为3，2 d翻堆一次，发酵周期20 d，同时设置一个对照组，对照组为纯牛粪堆肥（C/N为191），通过晾晒的方式，调整含水率。3）翻堆次数对发酵的影响将牛粪与稻壳粉按309的比例混合均匀，含水率为70%，原料的C/N为301，复合微生物菌剂的接种量为3，翻堆次数设4个水平，分别为1 d，3 d，6 d，9 d一次，发酵周期20 d。4）复合微生物菌剂接种量对发酵的影响将牛粪与稻壳粉按309的比例混合均匀，含水率为70%，原料的C/N为301，复合微生物菌剂的接种量设三个水平，分别为1，3，5，同时设置一个不接菌的对照组，2 d翻堆一次，发酵周期20 d。以上单因素试验均重复3次，数据均为3次试验的平均值。1.2.2正交试验根据单因素试验结果，采用4因素3水平的正交表（见表6）对复合微生物菌剂接种量、原料含水率、C/N、翻堆次数四个因素进行正交组合，采用种子发芽指数对发酵结果进行评价。1.3二次发酵工艺第一次发酵温度下降到45左右时，加入固氮细菌、解磷细菌和解钾细菌等有益微生物，进行第二次发酵，每天翻堆一次，使温度保持在适宜细菌生长繁殖范围内。测定二次发酵过程中固氮细菌、解磷细菌、解钾细菌活菌数的变化，确定二次发酵终止时间。1.4测定方法1.4.1温度测定由玻璃温度表检测，测发酵堆体四角3050 cm处及堆体中央共五处温度值，取平均值。中华人民共和国农业行业标准（NY/T 3942000）高温堆肥的卫生标准要求，高温堆肥的最高堆温达 5055，持续 57 d。对于好氧堆肥系统而言，温度是好氧堆肥生化活动的重要指标。优化各项工艺参数，目的是为了使堆体温度快速上升,并在 5060高温区维持一段时间，使有机物充分降解，最大程度地杀灭各种寄生虫卵、病原菌和杂草种子，使之达到无害化卫生标准8。1.4.2含水率检测称取试样20 g，在105下干燥24 h，恒重至0.1 g，测定含水率。1.4.3C/N比测定按土壤有机质研究法测定9。总碳的测定方法用重铬酸钾氧化外加热法。总氮的测定方法用重铬酸钾法 硫酸消化法。1.4.4种子发芽指数测定将20粒油菜种子放入铺有滤纸的培养皿内，并向培养皿内加入5 mL发酵产品浸提液，以蒸馏水做对照，每个样品做34次重复实验，在25下于种子发芽箱中培养96 h后，计算发芽率并测定根长，然后按以下公式计算种子的发芽指数。发芽指数GI/%=（处理种子发芽率 处理种子根长）/（对照种子发芽率 对照种子根长）100%目前较为公认的评价有机固体废弃物腐熟度的指标为种子发芽指数（GI），GI值可综合体现发酵物料的低毒性（影响根长）或高毒性（影响发芽），被认为是最敏感、可靠、有效和最能反映发酵产品植物毒性的判断物料无害化和腐熟度的参数。Zucconit等认为，当GI值0.5时，发酵物料对植物已基本没有毒性，发酵物料已基第 1 期曹慧玲等：添加复合菌剂好氧发酵牛粪生产生物肥料的工艺优化191本腐熟；当GI值0.8时，发酵物料完全腐熟10。1.4.5有效活菌数计数方法平板稀释活菌计数法，依据中国农用微生物菌剂标准（NY/T 8842004）中的测定方法进行。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1含水率对牛粪发酵的影响由图1和表2可知，含水率为60%时，物料升温速度最快，5.5 d后，达到55高温，最高温度为66，且高温保持8.5 d，符合中国农业部农业行业标准（NY/T 3942000）的卫生标准要求。70%含水率的处理，温度变化效果仅次于60%的处理。而含水率为80%的处理，最高温度仅为50，这是由于水分过多，取代了空气占据物料孔隙，限制了好氧微生物与氧气的接触，使好氧微生物活性降低，影响好氧发酵效果11-13。含水率为50%的处理，达到55高温所需的时间较长，这是由于稻壳粉的添加量较多，与牛粪的比例接近11，而稻壳粉中的粗纤维含量高，难于分解，不利于微生物的生长。由表2可知，50%、60%、70%含水率处理的种子发芽指数均达到80%以上，说明发酵物料中抑制种子发芽的有毒物质逐步被分解，物料已较好的腐熟，而80%含水率的处理，不符合发酵腐熟的要求。虽然60%含水率的处理物料升温快，高温保持时间长，腐熟度高，为最佳处理，但从工业化生产角度考虑，应尽量降低生产成本，减少稻壳粉的使用量。因此，试验选用70%含水率的处理作为工业化生产的工艺条件。图1含水率对发酵温度的影响Fig.1Effect of moisture content on fermentation temperature表2含水率对发芽指数的影响Table 2Effect of moisture content on germination index含水率/%50607080发芽指数/%81.689.386.8502.1.2C/N对发酵的影响图 2 和表 3 反映了物料不同 C/N 对发酵过程中温度和发芽指数的影响。C/N 为 301 时，物料升温速度快，最高温度为 64，达到 55高温所需时间为 7.5 d，并维持 8.5 d，符合中国农业部农业行业标准（NY/T 394-2000）的卫生标准要求，而对照组却一直未达到高温。C/N 为401 的处理，最高温度仅为 56，高温维持 1 d，不符合国家堆肥的卫生标准要求。这是因为 C/N 比过高，微生物由于氮不足，生长受到限制，有机物降解速率变缓，从而延长发酵时间；C/N 比过低，则发酵过程产生氨，不仅影响环境，而且造成氮的损失，导致产品质量下降14。C/N 比的控制通过添加调理剂来实现，本研究主要通过添加稻壳粉和尿素来调整物料的 C/N。由表 3 可知，C/N 为301 的处理的种子发芽指数达到 86.8%，说明物料已完全腐熟，其他两个处理的种子发芽指数均小于 80%。综合比较，将物料的 C/N 调整为 301 时，发酵效果最佳。图 2C/N对发酵温度的影响Fig.2Effect of ratios of carbon and nitrogen on fermentationtemperature表3C/N对发芽指数的影响Table3Effect of ratiosof carbon and nitrogen on germination indexC/N对照（191）301401发芽指数/%6986.8732.1.3翻堆次数对发酵的影响如图3和表4所示，在不同翻堆次数条件下，温度在发酵过程中的变化趋势基本一致，先后经历了升温期、图 3翻堆次数对发酵温度的影响Fig.3Effect of frequency of dig onfermentation temperature表4不同翻堆次数对发芽指数的影响Table 4Effect of frequency of dig on germination index翻堆次数/d1369发芽指数/%82.484.37875192农业工程学报2009 年高温期和降温期3个阶段。3 d翻堆1次的物料升温8.5 d达到55高温，并维持8.5 d，较6 d和9 d翻堆1次的处理高温维持时间长，且最高温度高，为65。1 d翻堆一次的处理物料升温速度最快，但最高温度和高温维持时间均次于3 d翻堆一次的处理。这是由于通风量太大，物料产生的热量散失过快，从而影响物料维持高温。种子发芽指数的测定结果如表4所示，1 d和3 d翻堆一次的处理均达到80%，符合物料腐熟的要求。综合比较，3 d翻堆一次的发酵效果最好，翻堆次数太多或太少，牛粪发酵效率都会受到影响。2.1.4复合微生物菌剂接种量对发酵的影响微生物是牛粪发酵过程中的关键因素，对发酵过程的控制，实际上就是对物料中微生物的控制。向物料中接种微生物菌剂，能够增加物料中微生物总数，由于各菌种之间相互协同作用，形成复杂而稳定的生态系统，使物料中的微生物迅速繁殖，发酵物料的高温期提前到来8。添加复合微生物菌剂，使发酵物料高温期维持时间长，加快物料的腐熟，提高物料的腐熟度。图4复合微生物菌剂接种量对发酵温度的影响Fig.4Effect of inoculating amount of compound microbes onfermentation temperature表5复合微生物菌剂接种量对发芽指数的影响Table 5Effect of inoculating amount of compound microbes ongermination index接种量/%对照135发芽指数/%5072.386.894.5由图 4 和表 5 可知，添加复合菌剂的发酵温度明显高于对照组，对照组最高温度不到 55。而接种 1、3和 5 复合菌剂的处理最高温度分别为 57、64和65，达到 55所用时间分别为 10 d、8 d 和 6 d。随着复合微生物菌剂添加量的增加，发酵物料的最高温度增高，升温速度加快，高温维持时间增长，物料的腐熟度提高，种子发芽指数增高。但接种量大于 3 时，对发酵物料的温度与腐熟度的变化无显著的影响，其中 3 和5 接种量的处理种子发芽指数均在 80%以上，符合物料腐熟的要求。基于降低成本的考虑，选择 3 的复合微生物菌剂接种量为工业化生产的工艺条件。2.2正交试验为进一步优化发酵工艺，根据单因素试验所得的各因素的最适范围，做4因素3水平的正交试验，由于生物方法测定发酵毒性，是检验发酵有机质腐熟度最有效的方法10,15，因此选择种子发芽指数对发酵结果进行最终评价，确定最佳发酵工艺条件。表6牛粪发酵的试验结果Table 6Results of fermentation of dairy manure序号A含水率/%BC/NC翻堆次数/d 次-1D接种量/发芽指数/%1652522.582.1265303385.23653543.587.64702533.593.25703042.589.5670352383.3775254383.28753023.589.19753532.580.6K18586.284.884.1K289.88886.384.9K384.384.886.889.9R5.53.225.8由表6极差分析可知，各因素的主次关系为DABC，即复合微生物菌剂的接种量对发酵的影响最大，原料含水率的影响次之，C/N和翻堆次数的影响较小。最佳发酵工艺条件组合为A2B2C3D3，即原料含水率为65%，C/N为301，菌剂接种量为3.5，翻堆次数为4 d一次。由于所选的处理组合不在试验中，因此对A2B2C3D3组合进行验证试验。试验结果表明，在此条件下，物料可以顺利实现升温，第3d温度上升至55，并维持10 d，达到了中国农业部农业行业标准（NY/T 394-2000）的卫生标准的要求，发酵20 d，发芽指数达到93.6%，说明物料已较好的腐熟。3结论本研究通过单因素试验和正交优化试验，得到了牛粪好氧发酵生产生物有机肥的一次发酵最佳工艺参数，即物料含水率为65%，C/N为301，菌剂接种量为3.5，翻堆次数为 4 d 一次，发酵 20 d 后，发酵产物的种子发芽指数可达到 93.6%。本研究还采用了二次发酵工艺，在一次发酵后，添加复合有益微生物菌剂，可提高土壤肥力，使发芽指数提高到 96.8%。在本研究得到的优化工艺条件下，牛粪好氧发酵的升温速度快，高温维持时间长，发酵周期短，发酵所得的生物有机肥产品的腐熟度高，有益微生物的活菌数高，提高了牛粪发酵效率和发酵产品质量，为牛粪的大规模处理及为生物有机肥的生产提供了必要的工艺参数和一定的理论依据。参考文献1张克强，高怀文畜禽养殖业污染物处理与处置M北京：化学工业出版社，2004：19232郑瑞生，封 辉，刘 泓，等 畜禽粪便高温好氧堆肥的NH3挥发及其调控J亚热带农业研究，2006，2(1)：65683李国学，李玉春，李彦富固体废物发酵化及发酵添加剂第 1 期曹慧玲等：添加复合菌剂好氧发酵牛粪生产生物肥料的工艺优化193研究进展J 农业环境科学学报，2003，22(2)：252256Li Guoxue,Li Yuchun,Li Yanfu.Advance on composting ofsolidwaste andutilization of additivesJ.Journal ofAqro-environmental Science，2003，22(2)：252256(inChinese with English abstract)4陈志强，吕炳南，于春晓，等城市垃圾好氧堆肥处理的几个关键问题J城市环境与城市生态，2002，(6)：4546Chen Zhiqiang,Lu Bingnan,Yu Chunxiao,et al.Severalimportant problems about aerobic composing process ofmunicipal 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microbial community which contained nitrogen fixationmicroorganism,phosphate solubilizing microorganism and potassium dissolving microorganism,were appended in the secondfermentation with inoculation quantity of 1%after 15-day main fermentation.The termination time of the second fermentationwas determined by measuring the quantity variations of beneficial microorganisms.The results indicated that the optimalconditions of the main fermentation could be as follows:moisture content of 65%,ratio of carbon to nitrogen of 30:1,inoculation quantity of 3.5 and dig frequency of one time every four days.The main and second fermentation took 15 daysand 6 days respectively.Results under the optimal fermenting conditions are as follows:materials can warm up fast andmaintain a long period at a high temperature;the bioorganic fertilizer has a high degree of maturity and a short fermentationcycle;the number of effective bacteria and germination index amounts to 5.2 109cfu/g and 96.8%,respectively.Key words:dairy manures,aerobic fermentation,bioorganic fertilizers,complex microbial community