专业基础课《分子生物学》课程教学大纲(普通班).pdf

分子生物学 课程教学大纲 适用对象：本科药学专业中文班 （学分：3 学时：54 ）一、课程的性质和任务：分子生物学是研究生物基因表达规律、探索生命奥密的一门基础理论科学，也是研究基因的结构和功能的科学，也是高等院校生物学专业必修课程之一，面向生物技术专业和生物科学专业。本课程应在无机及分析化学、有机化学、生物化学等课程之后开设，同时又是动物生理学、植物生理学、遗传学、细胞生物学、微生物学等课程的专业基础课。分子生物学是生物学科发展最快的学科，在推动二十一世纪生物技术产业的崛起、推动国民经济持续高速发展等方面均有重要的作用。通过对本课程的学习，使学生掌握分子生物学的发展史及研究内容；DNA 的结构和功能；基因组的特点及其研究方法；DNA 的复制和损伤的修复；RNA 的生物合成和剪接加工；蛋白质的生物合成；分子生物学的基本研究方法和技术手段；原核生物和真核生物基因表达的调控的等内容。理论教学 36 学时，实验教学 18 学时。通过本课程学习，使学生掌握分子生物学的基本原理和实验技能，具备从事与分子生物学相关学科的科研工作的初步能力，并为后续课程的学习打好坚实的基础。二、教学内容和要求（含每章教学目的、基本教学内容和教学要求）：第一章 绪论【教学基本要求】掌握分子生物学的概念和研究范畴，熟悉分子生物学的发展历史。【教学具体内容】一、分子生物学的概念 二、分子生物学研究的内容 基因与基因组的结构与功能；DNA 的生物合成、修复和重组；RNA 的生物合成和转录产物的加工；蛋白质的生物合成；基因表达的调控；穿插介绍相关的研究技术。三、分子生物学的发展和展望 人类对 DNA 和遗传信息传递的认识阶段；重组 DNA 技术的建立、发展和应用；结构基因学和功能基因学的发展现状和发展趋势。第二章 染色体与 DNA 【教学基本要求】掌握 DNA 的一二三级结构、性质和功能；熟悉原核生物和真核生物基因组的特点，掌握 DNA 复制过程及 DNA 变性复性等概念及影响因素。【教学具体内容】第一节 染色体和 DNA 的结构 一、DNA 的一级结构：是指 4 种核苷酸的连接及排列顺序，表示了 DNA 分子的化学构成。二、DNA 的物理图谱 三、DNA 一级结构的测定 四、DNA 的双螺旋结构 一类是右手螺旋，如、B-DNA、C-DNA、D-DNA、E-DNA、A-DNA；另一类是局部的左手螺旋，即 Z-DNA。五、DNA 的三股螺旋结构 六、DNA 超螺旋结构 可分为正超螺旋与负超螺旋两类。七、核小体与染色体 核小体：DNA 双螺旋链,等距离缠绕组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)各二分子组成八聚体形成众多核心颗粒。1、组蛋白特征 2、非组蛋白 八、DNA 结构的不均一性 九、DNA 的变性、复性和分子杂交 1、DNA 的变性（denaturation）2、DNA 的复性：热变性 DNA 一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。3、核酸的分子杂交：Southern 印迹分析，Northern 印迹分析，菌落或噬菌斑原位杂交。十、基因与基因组 基因：一般是指表达一种蛋白质或功能 RNA 的遗传物质的基本单位。基因组：是指某种生物所包含的全套基因。（一）原核基因组 1、病毒基因组：2、细菌基因组：细菌基因组含有染色体和染色体外的 DNA质粒。1）质粒的特点：独立于染色体之外的双链环状 DNA 分子，含有遗传信息能进行自主复制 2)细菌基因组的结构特征（二）真核基因组 真核基因组结构特征 1、重复序列，2、基因割裂现象，3、假基因，4、基因家族 第二节 DNA 的复制 一、DNA 复制的方式及一般过程：(一)DNA 的半保留复制(semiconservative replication)半保留复制的实验依据（二）DNA 复制的一般过程：二、DNA 复制过程的三个阶段（一）DNA 复制的起始阶段：1、DNA 复制起始点的结构特性：2、DNA 复制的方向性：3、DNA 复制的起始：。（二）DNA 链的延长 1、DNA 聚合酶：1 2、与超螺旋松驰有关的酶 （三）DNA 复制的终止阶段 真核生物线性 DNA 末端具有端粒结构。端粒的结构：端粒 DNA 的合成一种特殊的反转录酶叫做端粒酶(telomerase)。1、反转录酶的催化作用：2、反转录酶的特点：3、反转录酶发现的意义 三、基因重组和基因移动：基因重组和基因移动是生物进化的动力，具有重要的生物学意义。1、基因重组 2、基因移动 插入序列（insertion sequence，IS），转座子（Transposon,Tn）四、基因突变和基因的损伤与修复 1、基因突变的分类：2、突变可能造成的后果：3、基因突变的特征：4、基因的损伤:。引起基因损伤的因素：1）物理因素：a、紫外线 b、电离辐射。2）化学因素 a、烷化剂，b、核苷酸类似物，c、代谢产生的活性物质。3）生物因素 ：DNA 病毒和 RNA 病毒感染、质粒转移、基因重组、转座子的转位 4）自发损伤或突变 5、基因修复 1）直接修复：a、光修复：b、烷基转移修复。2）碱基切除修复。3)核苷酸切除修复。第三章 生物信息的传递（上）从 DNA 到 RNA【教学基本要求】掌握几种不同 RNA 的结构特点和功能特点。了解转录的过程，掌握起始和终止的协助因子。掌握 RNA的转录后加工的类型及其作用。【教学具体内容】第一节：RNA 的结构与功能 一、tRNA（结构）tRNA 的二级结构(三叶草结构)三叶草结构的共同特点：tRNA（功能）：a、起始 tRNA 和延伸 tRNA，b、同工 tRNA，c、校正 tRNA。二、rRNA 占细胞内总 RNA 量的 80%，为蛋白质的合成提供场所。原核生物和真核生物核蛋白体均由易于解聚的大、小亚基组成，原核 rRNA 主要分为 5S、16S、23S 三种；真核 rRNA 主要分为 5S、28S、5.8S、18S，S 是大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可反映分子量的大小。三、mRNA 1、mRNA 在细胞内只占总 RNA 的 1%-2%。2、mRNA 的代谢很快。3、真核生物中 hnRNA 是 mRNA 的未成熟前体，也称为不均一核 RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)。4、hnRNA 与 mRNA 之间的差别 mRNA5/端的帽子功能：mRNA3/端 polyA 尾巴的功能：四、snRNA 参与 RNA 的剪接。五、小胞浆 RNA(scRNA)是蛋白质定位合成于粗面内质网上所需的信号识别体(signal recognization particle)组成成分。六、反义 RNA（antisense，anRNA）1）抑制 DNA 复制：作为 DNA 复制的抑制因子，它可与引物 RNA 互补结合。2）抑制转录：在转录水平上，反义 RNA 可与 mRNA 5末端互补，阻止 RNA 的转录。3）抑制翻译：三种作用，一是与 mRNA5 端不译区结合，直接抑制翻译；二是与起始密码子结合抑制翻译起始；三是与 mRNA 非编码区结合引起 mRNA 构象改变，从而影响翻译。七、核酶（ribozyme）具有酶的催化活性可在预选位点剪切 RNA 的反义 RNA 又称酶 RNA。第二节 转录 RNA 的生物合成 一、依赖 DNA 的 RNA 聚合酶（DDRP)1、原核生物 RNA 聚合酶 全酶由六个亚基组成，去掉亚基的部分称为核心酶（2/）2、真核生物 RNA 聚合酶 真核生物有四种 RNA 聚合酶，分别称 RNA 聚合酶、和线粒体 RNA 聚合酶。RNA 聚合酶：位于核仁中，转录编码 rRNA。RNA 聚合酶：位于核质中，转录核内 hnRNA RNA 聚合酶：位于核质中，转录合成 tRNA 和许多小的核 RNAs。二、RNA 转录过程可分为识别、起始延长和终止三个阶段。（一）识别：即 RNA 聚合酶全酶识别启动子 1、原核生物启动子核苷酸序列的特点：2、真核生物的启动子（二）转录起始和延伸 1、原核生物转录起始：因子从全酶解离下来，靠核心酶在 DNA 链上向下游滑动。2、真核生物转录起始 需要多种蛋白因子的协助，它们与 RNA 聚合酶形成转录起始复合物，共同参与转录起始的过程。转录因子（Transcription Factor)结合顺序：D-A-B-F-E-H（三）转录的终止 一类是不依赖于蛋白质因子而实现的终止作用 另一类是依赖蛋白质辅因子因子才能实现终止作用 第三节 真核生物 RNA 的转录后加工 真核生物从断裂基因产生的 mRNA 要经过复杂的加工历程：mRNA 的加工 5端加帽：3端加尾：RNA 的剪接(splicing)：RNA 的编辑（editing）：第四章 生物信息的传递（下）从 RNA 到蛋白质【教学基本要求】掌握蛋白质合成的分子基础，熟悉蛋白质合成的详细过程。一、蛋白质生物合成的概述 mRNA 是蛋白质合成的模板；tRNA 转运活化的氨基酸至 mRNA 模板上；核糖体是蛋白质合成的场所；参与蛋白质合成的各种辅因子。二、遗传密码的破译与遗传密码的特征 遗传密码是三联体；用人工合成的多聚核苷酸破译遗传密码起始密码和终止密码；用人工合成的三核苷酸破译遗传密码。遗传密码是连续排列的三联体；起始密码与终止密码；密码简并性；密码的变偶性；遗传密码的 通用性和变异性；遗传密码的防错系统。摆动假说.三、tRNA 与氨酰-tRNA 的合成（一）tRNA 的结构 1、二级结构：三叶草形 2、三级结构：“L”形（二）tRNA 的功能 1、解读 mRNA 的遗传信息 2、运输的工具，运载氨基酸 tRNA 有两个关键部位：3端 CCA，反密码子部位（三）tRNA 的种类 1、起始 tRNA 和延伸 tRNA 2、同工 tRNA 3、校正 tRNA：校正 tRNA 通过改变（四）氨酰-tRNA 合成的反应；氨酰-tRNA 合成酶的特异性。四、核糖体 （一）核糖体的结构 1、核糖体由大小两个亚基组成 2、核糖体蛋白 3、核糖体 RNA 组成和功能特点 1）5S rRNA，（2）16S rRNA，（3）23SrRNA，（4）5.8SrRNA 4、核糖体有 3 个 tRNA 结合位点：A 位P 位E 位。（二）核糖体的自我组装（三）核糖体的功能：小亚基的功能，大亚基的功能 五、原核生物的蛋白质合成 原核生物肽链合成的起始；原核生物肽链的延伸；原核生物肽链合成的终止。六、真核生物的蛋白质合成 真核生物肽链合成的起始；真核生物肽链的延伸；真核生物肽链合成的终止。七、蛋白质生物合成的抑制剂 许多抗生素都能够抑制细菌细胞内蛋白质合成，5-甲基色氨酸、环己亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白、等也都能抑制蛋白质的合成。原核生物肽链合成的抑制剂；真核生物肽链合成的抑制剂。第十章 肽链合成后的加工和输送 一、肽链的剪接和加工 肽链的剪接（N 端 fMet 或 Met 的切除，切除新生肽链中非功能片段）；氨基酸残基的修饰；多链的折叠。二、肽链合成后的定向输送 翻译转运同步机制；翻译后转运机制。信号识别颗粒 第五章 分子生物学研究法（上）DNA、RNA 及蛋白质操作技术【教学基本要求】掌握 DNA 体外重组的概念及基本流程；学习 DNA 文库的构建流程；掌握 PCR 等技术的原理及操作，了解实时定量 PCR 等技术的原理；了解 RNA 及蛋白的操作技术。【教学具体内容】一、DNA 体外重组的基本含义 1、DNA 体外重组的基本概念：2、DNA 体外重组的基本过程：二、限制性内切酶 限制酶产生末端的连接 a、粘性末端互补 b、不匹配末端连接 c、平末端连接 三、其他常用的工具酶 （一）DNA 聚合酶 1、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 2、Klenow 酶 3、Tag DNA 聚合酶 4、逆转录酶（依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶）。（二）T4 噬菌体 DNA 连接酶（三）碱性磷酸酶（四）核酸酶 1、S1 核酸酶：2、核糖核酸酶（RNaseA)四、常用的载体 1、质粒载体 (1)质粒的生物学基本特性 a、自主复制性：b、不相容性：c、稳定性 d、寄生性：e、复制类型：（2）质粒 DNA 的构型，具有三种不同的构型：SC 构型；oc 构型；L 构型。(3)实验室常用质粒 a、pBR322 b、pUC18/19（7）质粒的制备 实验室一般使用两种方法制备质粒 I.碱裂解法 II、沸水浴法 2、噬菌体载体：噬菌体的繁殖方式有两种：溶菌性方式（lytic pathway）；溶原性方式（lysogenic pathway）。3、考斯质粒（粘性质粒，cosmid）：考斯质粒是含有 l-DNA 两端 cos 区的质粒 理想的基因工程载体的一般要求。五、目的基因的获得 （一）原核生物基因文库的构建（二）真核生物目的基因的获得 1、cDNA 文库的构建：2、cDNA 文库目的基因的筛选 3、化学合成法获得目的基因：PCR 反应过程：变性，退火，延伸 逆转录 PCR。实时定量 PCR。六、外源基因表达系统（一）大肠杆菌表达系统（二）酵母表达系统（三）昆虫细胞表达系统（四）哺乳类细胞表达系统 七、蛋白质与蛋白质组学技术 蛋白质组学 蛋白质组的广义认识。双向电泳（two-dimensional electrophoresis）（一）第一向等电聚焦；（二）第二向 SDS-PAGE 电泳 第六章：分子生物学研究法（下）基因功能研究技术 一、基因表达研究技术（一）基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）（二）RNA 的选择性剪接技术 常用 RT-PCR 法（反转录 PCR）研究某个基因是否存在选择性剪切。（三）原位杂交技术 RNA 原位杂交:染色体原位杂交：（四）基因定点突变(site-directed mutagenesis)该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变编码的氨基酸序列，主要采用 PCR 方法.二、基因敲除技术（一）基本原理 经典遗传学（Forward genetics）现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶 基因敲除分为：完全基因敲除：条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）（二）高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线主要包括：转基因动物（transgenic animal)：嵌合体动物。1、转基因动物的发展 2、转基因动物的基本过程 3、转基因动物的方法 3-1、逆转录病毒感染法：3-2、DNA 显微注射法：3-3、胚胎干细胞法（三）、植物基因敲除技术 T-DNA 插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。T-DNA：是农杆菌 Ti 或 Ri 质粒中的一段 DNA 序列。三、蛋白质及 DNA/RNA 相互作用技术（一）酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）（二）酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）四、RNAi（RNA interference,RNA 干涉）技术及其应用 RNAi 技术：单链 RNA（ssRNA,single-stranded RNA）的降解。Dicer（一种具有 RNAase III 活性的核酸酶）的加工 小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标 mRNA。RNA 诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体。五、基因芯片及数据分析 基因芯片（DNA chip），又称 DNA 微阵列（DNA microarray）技术 基因芯片的测序原理是杂交测序方法 基因芯片可用于进行基因诊断。六、印迹法 Blotting Methods Southern blotting Northern blotting Western blotting 分别可对 DNA/RNA/蛋白质进行分析。六、蛋白-DNA 相互作用分析 Electrophoretic mobility shift assay 凝胶阻滞分析 DNase footprinting assay：DNase 足迹法分析 Chromatin immunoprecipitation.染色体免疫共沉淀 Yeast One-hybrid System(Y1H)酵母单杂 Bacterial one-hybrid system(B1H)细菌单杂 第七章：原核生物基因表达调控【教学基本要求】掌握原核生物基因表达调控的基本规律；熟悉典型的操纵子乳糖操纵子和色氨酸操纵子。【教学具体内容】一、原核生物基因表达调控总论 原核生物基因调控一般执行如下规律：一个体系需要时被打开，不需要时被关闭。基因的开-关的活性可以通过转录水平上进行调节。基因表达调控主要表现在二个方面：转录水平上的调控（Transcription regulation)，转录后水平上的调控（post-transcription regulation)包括：mRNA 的成熟加工、蛋白质的翻译等。1、原核生物基因调控机制的类型：A、代谢产物对基因活性的调节：诱导调节；阻遏调节。原核生物基因调控主要发生在转录水平上，负转录调控（negative trnscription regulation)，调节基因的产物是阻遏蛋白，阻止基因的转录包括：负控诱导；负控阻遏。正转录调控（positive transcription regulation)调节基因的产物是激活蛋白包括：正控诱导；正控阻遏。B、弱化子对基因活性的影响：在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列，称为弱化子。C、降解物对基因活性的调节：葡萄糖效应或降解物抑制作用。D、细菌的应急反应：信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸（pppGpp），是由空载的 tRNA 所引起的。称他们是超级调控子或称为魔斑。2、启动子与转录起始：3、增强子可以提高转录的水平：4、RNA 聚合酶与启动子的相互作用：因子对转录起始的调控 5、环腺苷酸受体蛋白对转录的调控：环腺苷酸（cAMP）受体蛋白 CRP（cAMP receptor protein），激活蛋白 CAP（cAMP activated protein），CAP 具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。二、乳糖操纵子 （一）乳糖(lac)操纵元的表达调控 1、阻遏蛋白的负性调控：2、CAP 的正性调控：1ac 操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过 CAP 的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。三、半乳糖（gal)操纵子 1、Gal 操纵子的结构特征：gal 操纵子有两个启动子，PG1 和 PG2。它有两个 O 区。2、CAP 对 gal 操纵子的作用：。3、双启动子的生理功能：半乳糖对细菌有双重作用；一方面可以作为碳源供细胞生长；另一方面它又是细胞壁的成分。四、色氨酸操纵元(一)色氨酸操纵元的结构与阻遏蛋白的负调控 (二)衰减子（弱化子）及其作用 、色氨酸（Trp)操纵元结构特征：、衰减子终止转录的作用：五、阿拉伯糖操纵子；组氨酸操纵子。六、翻译水平的调控 mRNA 高级结构对翻译的调控；反义 RNA 对翻译的调控；翻译水平的自身调控；严谨调控；核开关。第八章 真核生物基因表达调控 【教学基本要求】熟悉真核基因组结构特点，了解真核基因表达调节基本规律，掌握真核生物中基因表达调节的发生的不同阶段。【教学具体内容】一、真核生物表达调控基本概念和规律（一）、真核基因组结构特点 原核生物基因组结构特点（二）、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及 DNA 的空间结构方面的差异（三）基本概念 基因家族，断裂基因，假基因 基因家族（gene family)：1、简单多基因家族 2、复杂多基因家族 3、发育调节的复杂多基因家族 二、真核基因表达调控的特点 1、基因组 DNA 存在的形式：（1）染色质结构影响基因转录；（2）组蛋白的作用；（3）转录活跃区域对核酸酶作用敏感度增加，对 DNase 高敏感点。（4）DNA 拓扑结构变化；（6）CG 岛；没有被甲基化的 CG 小片段，称为 CG 岛 2、转录在细胞核、翻译在细胞质中进行：扩大了基因表达调控的范围。3、基因表达调控在多个水平上进行：顺式作用元件，反式作用因子的相互作用。4、不同组织和细胞类型合成不同的蛋白质：一个物种的所有细胞含有相同的 DNA，在个体发育中开启、关闭基因是受到严格控制的。5、真核生物基因调控的信号分子：蛋白因子、激素等其它信号分子作为基因的调控物质。6、持家基因和时态基因。三、转录前调控：染色质结构与基因表达调控 1、DNA 水平的调控是发育调控的一种形式：包括：基因丢失、扩增、重排和移位等方式。2、X 染色体失活：雌性胎生哺乳类动物细胞中两条 X 染色体之一在发育早期随机失活。四、转录调控 1、顺式作用元件(cis-acting elements)：主要是起正性调控作用的元件，包括启动子、增强子；负性：沉寂子/沉默子。启动子中的元件可以分为两种：核心启动子元件(core promoter element ,CPE)；上游启动子元件(upstream promoter element ,UPE)或称上游激活序列（upstream activating sequence,UAS)。2、反式作用因子(trans-acting factors)：以反式作用影响转录的因子(transcription factors,TF)。3、与DNA结合常见的蛋白质功能域：螺旋-转角-螺旋(helix turn helix,HTH)；螺旋-环-螺旋(helix loop helix,HLH)；锌指（zinc finger）；碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）；同源域（Homeodomain）4、转录活化结构域：带有负电荷的螺旋结构；富含谷氨酰胺的结构；富含脯氨酸的结构。五、转录后调控 1、RNA 加工成熟：无论是 rRNA、tRNA、mRNA，转录后都必须经过加工，才能成为有功能的分子。2、转录后加工的多样性 （1）简单转录单位：（2）复杂转录单位 四、翻译调控 1、蛋白质合成的起始-扫描模式。2、mRNA 帽子结构的识别。3.mRNA 稳定性控制。4.蛋白质因子的修饰与翻译起始调控。六、翻译后调控 多肽的切割：切去前端的信号肽；多肽的有限水解：酶原水解；多肽的化学修饰：磷酸化、糖基化；多肽的剪接：剪接成数个片段，再以一定的顺序结合起来，形成有活性的蛋白质。七、真核基因转录调控的主要模式 1、蛋白质磷酸化。2、蛋白质磷酸化在信号传导中的作用。第一信使，如生长因子、细胞因子、胰岛素等。第二信使，如：Ca2+、IP3、DAG、cAMP、cGMP 等。3、跨膜信号转导途径 4、蛋白激酶的种类与功能：。5、激素调节：激素调控作用是通过启始基因转录而实现的。cAMP 作为第二信使。6、组蛋白的乙酰化及去乙酰化 三、课程的重点和难点：1、理解基因和基因组的结构、组成和功能；从分子机制角度生命遗传信息的存储者的本质。2、掌握复制、转录、翻译及各种之间的加工步骤，了解参与的各种蛋白和其他因子的功能，认识从微小单细胞生物到复杂高等生物的生命活动的本质。3、理解遗传信息的表达过程中的多层面表达调节，从而构成一个复杂而精细的表达调控网络。4、掌握分子生物学的基本操作技术，包括核酸操作、蛋白操作及其功能研究的有关方法。四、参考性教学时间安排：教学内容 授课学时 实验（上机）学时 实践学时 分子生物学绪论 2 染色体与 DNA 4 生物信息的传递（上）从 DNA 到 RNA 4 生物信息的传递（下）从 RNA 到蛋白质 6 分子生物学研究法（上）DNA、RNA 及蛋白质操作技术 5 分子生物学研究法（下）基因功能研究技术 4 原核生物基因表达调控 4 真核生物基因表达调控 3 实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 5 实验二 聚合酶链反应技术 实验三 DNA 的琼脂糖凝胶电泳及其切胶回收 5 实验四：质粒 DNA 的分离纯化及酶切 5 实验五：质粒 DNA 的酶切及电泳分析鉴定 3 合计 32 18 五、实践（实验）教学环节（含实验项目、实践内容）：实验课 实验一：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 一、实验目的 1、掌握 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法 2、掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法。二、实验原理 细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2 等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过的感受态细胞。进 入细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的 遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2 法），该法最先是由 Cohen 于 1972 年发 现的。其原理是细菌处于 0，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过中获得的新的表型（如 Ampr、Kanr 等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄/卡那青霉素的选择培养基上。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到 51062107 转化子/ug 质粒 DNA，可以满足一般的基因克隆试验。转化(Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性 状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。实验二 聚合酶链反应技术 一、实验目的 1了解 PCR 基因扩增技术在 DNA 操作中的重要性及应用范围。2熟悉 PCR 基因扩增的基本原理。3掌握 PCR 基因扩增技术的具体操作过程。二、实验原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是在模板 DNA、引物和四种 dNTP 存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应。在反应中混合下列物质：模板 DNA、四种 dNTP(包括 dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、引物 1、引物 2、Taq DNA 聚合酶、缓冲液及 Mg2+(MgCl2)，然后经下列过程大量扩增靶DNA，类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 分为三步：变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链 DNA；退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；延伸：在 DNA 聚合酶、dNTPs 和 Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的 DNA 链延伸反应。以以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性 DNA 片段得到大量的复制，数量可达到1067 个拷贝。实验三 DNA 的琼脂糖凝胶电泳及其切胶回收 一、实验目的 1了解琼脂糖凝胶电泳的原理。2熟悉琼脂糖凝胶的配制及 DNA 琼脂糖凝胶电泳操作。3掌握 DNA 切胶回收的具体操作过程。二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖是由-D-吡喃型半乳糖和 3,6-脱水-L-吡喃型半乳糖以糖苷键（1,3-1,4）相互交替链接而成的一种线性半乳多聚糖，能够在热的溶剂中溶化并在冷却过程中形成凝胶。琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片断的典型方法，其特点为简便、快速。在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电场中向正极移动。由于核酸分子结构的重复性，核苷酸数相同的不同核酸几乎具有等量的净电荷，所以在电场中核酸携带的电荷差异几乎不造成核酸迁移率的差异，而真正决定核酸分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素，是核酸分子的大小和构象。在适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，通过琼脂糖的分子筛作用，使 大小和构象不同的核酸分子泳动距离出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。实验四：质粒 DNA 的分离纯化 一、实验目的 1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒 DNA 的原理和方法。二、实验原理 整合外源 DNA 并将其带入宿主细胞的过程是分子克隆的关键。在所有载体中通用型大肠杆菌质粒载体因具有通用引物序列、多克隆位点区具极多的内切酶特异序列、许多具互补性质等特点而成为最基本的通用克隆载体。质粒 DNA 的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒 DNA 的纯化。菌体裂解方法不同，决定了质粒 DNA 提取方法的差异，目前菌体裂解方法主要有煮沸法，SDS 法，碱变性抽提法/碱裂解法,Triton-溶菌酶法等。质粒DNA 的纯化方法主要有梯度离心法、柱层析法等。碱裂解法是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性差异而达到分离的目的。在 pH 高达 12.5 的条件下，染色体 DNA 的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用 pH4.8 的醋酸钾高盐缓冲液调节 pH 至中性时，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体 DNA 不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子 RNA、蛋白质等一起沉淀出来。实验五：质粒 DNA 的酶切及电泳分析鉴定 一、实验目的 1、掌握 DNA 的限制性内切酶酶切技术。2、学习和掌握质粒 DNA 的电泳分析及酶切结果分析。二、实验原理 限制性内切酶是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶,这类酶的发现和应用促进了以 DNA 重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。本部分实验主要通过 Hind III 常用限制性内切酶对 pTag RFP N 载体（4.7kb）进行单酶切操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术。另外，本实验还对各种 DNA（核酸回收产物，质粒和酶切后的质粒）进行电泳分析。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，同一质粒 DNA 可能呈现以下不同的构型：超螺旋型，即共价闭合环状 DNA（cccDNA）；一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环 DNA（ocDNA）；两条链都发生了随机的断裂成为线状 DNA。在这三种构型中，cccDNA 由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；线状 DNA 受到的阻力增大，迁移速度变慢；ocDNA 因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度最慢。后两种构型的迁移顺序有争议。电泳分析中，可通过单酶切条带来分析线性构型质粒的条带。六、教材和主要参考书：1、Benjamin Lewin-Genes X，XI，published by Jones&Bartlett Learning，2011，2014 2、朱玉贤、李毅等现代分子生物学第四版，高等教育出版社，2012。3、Robert F.Weaver-Molecular Biology,Fifth Edition，Published by McGraw-Hill Higher Education，2012。4、郝福英，周先碗，朱玉贤，基础分子生物学实验，北京大学出版社，2010。5、魏群，分子生物学实验指导Laboratory manual for molecular biology，高等教育出版社，2015。七、其他说明：注：1、表格不够可自行添加。2、范文可参见教务处主页上教学大纲一栏中土木系教学大纲。