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第四章细胞生物反应器生物反应器是利用生物催化剂进行化学反应的设备，依据所运用的生物催化剂不同，又可分为酶反应器和细胞生物反应器。生物反应器和化学反应器的不同：大多数生物反应器须要不断通入无菌空气。避开染菌。第一节发酵罐发酵罐是一种重要的生物反应器，是依据发酵过程的工艺要求，保证和限制各种生化反应条件(T、P、O2、防止杂菌污染)，以促进微生物的新陈代谢，使之能在低消耗下获得较高产量的一种设备。分类微生物有好氧和厌氧两大类，培育这两大类微生物的发酵罐有很大的区分。相应地发酵罐可分为以下两种：1好氧发酵罐：氨基酸、有机酸、酶制剂、抗生素和单细胞蛋白均由此方法制得。在生产过程中需通入无菌空气，因此其设备的结构要比厌氧发酵困难些。2厌氧发酵罐厌氧发酵也称静止培育，因其不需供氧，所以设备和工艺都较好氧发酵简洁。严格的厌氧液体深层发酵的主要特色是解除发酵罐中的氧。罐内的发酵液应尽量装满，以便削减上层气相的影响，有时还需充人非氧气体。发酵罐的排气口要安装水封装置，培育基应预先还原。好氧发酵罐生产上依据发酵罐通风和搅拌方式的不同可将其分为：机械搅拌式通风发酵罐、自吸式发酵罐、气升式发酵罐和塔式发酵罐。一、通用式发酵罐通用式发酵罐是指既具有机械搅拌又有压缩空气分布装置的发酵罐。由于这种型式的罐是目前大多数发酵工厂最常用的，所以称为“通用式”。目前最大的通用式发酵罐容积约为480m3。特点轴封严密，泄漏少能承受确定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）1、几何尺寸HH筒身高度筒身高度 DD罐径罐径 BB挡板宽度挡板宽度 H HL L液位高度液位高度DiDi搅拌器直径搅拌器直径 SS两搅拌器间距两搅拌器间距2、装料容积公称容积V0是指圆筒部分容积Vc和底封头的容积Vb之和。对于椭圆形封头，对于标准椭圆形封头，若罐身高径比H/D=a，则通常装料系数在生产设计中，依据年产量和发酵周期可得出V，选择适合的装料系数，可确定V0，再依据上式可求出D，最终依据通用式发酵罐各尺寸与D的关系确定其他几何尺寸。3、结构(1)罐体罐体一般由不锈钢制成，应保证无死角、渗漏、积液。(2)搅拌装置机械搅拌罐的混合主要是通过机械搅拌来实现。机械搅拌一方面可以使罐内物料混合良好，液体中的固形物保持悬浮状态，有利于固体和养分物质充分接触，便于养分吸取；另一方面，可以打碎气泡，增加气液接触面积，提高气液间的传质速率，加强氧的传递效果及消退泡沫。搅拌器型式搅拌装置由安装在一根轴上的多个搅拌浆组成的，它可以使被搅拌的物料产生轴向和径向流淌。常用的搅拌器型式有：旋桨式、涡轮式、锚式和框式等。旋桨式搅拌器：又称推动式搅拌器。特点：结构简洁、安装简洁、转速快、循环量大。锚式和框式搅拌器：叶片大、转速慢、搅动范围大，适合高黏度物质混合。涡轮式搅拌器：工作原理与双吸式离心泵相像，适合低黏度和中等黏度液体搅拌。一般状况下同一搅拌轴要配置多个搅拌器，当容积大于15m3时，接受三层搅拌，小于15m3时，接受二层搅拌。搅拌功率与搅拌效果通过搅拌将能量作用液体，使达到混合和分散液团的目的。在消耗相同的功率的条件下，对不同的搅拌目的，应对功率作不同的安排。若搅拌器功率不变，增大搅拌器直径，则降低搅拌转速，由此翻动量增加、动压头下降；减小搅拌器直径，则可以增加搅拌转速，由此翻动量下降、动压头增大。(3)挡板挡板的作用是防止液面中心产生漩涡，促使液体激烈翻动，提高溶解氧。增加挡板将增加阻力，使得搅拌功率大大增加，混合效果会相应提高。全挡板条件：指在确定条件下，再增加挡板数量，功率仍保持不变。要满足全挡板条件，须满足下式要求：(4)通气装置是从罐的底部向罐内通入无菌空气，一般入口处的压力为0.1-0.2MPa，罐顶部有空气出口。该设备一般接受空气分布器将无菌空气引入到发酵液中。空气分布器一般用单孔管，开口向下，避开培育液中的固体物料在管口积累而增加污染的机会。(5)传热装置保证发酵过程在恒温条件下进行，将生物氧化和机械搅拌产生的热量刚好除去。容积小于5000L的发酵罐一般接受外夹套作为传热装置；容积大于5000L的发酵罐则接受立式蛇管作为传热装置。(6)机械消沫装置大量泡沫产生导致发酵液的外溢和染菌机会增大，使得装料系数降低。消退泡沫的方法是加入消泡剂和运用机械消沫装置。常用的机械消沫装置为耙式消沫浆。(7)尾气处理装置基因工程发酵的尾气必需经过适当处理后才能排放到大气中。要使尾气无菌，一般实行过滤除菌法。二、其他类型发酵罐1、自吸式发酵罐自吸式发酵罐是一种不须要空气压缩机，而在搅拌过程中自吸入空气的发酵罐。该反应器最关键部件是带有中心吸气口的搅拌器。搅拌器叶轮旋转时，叶片不断排开四周的液体使其背侧形成真空，由导气管吸入罐外空气，吸入的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，并马上通过导轮向罐壁分散，经档板折流涌向液面，匀整分布。1 带轮带轮(带动轴旋带动轴旋转转)2 排气阀排气阀 3 消泡器消泡器 4 冷却水管冷却水管 5 电机电机 6 导气管导气管 7 支架支架4256713特点优点：不须要空气压缩机。降低设备成本。缺点：进罐空气处于负压状态，杂菌简洁侵染。搅拌转速高有可能切断微生物菌丝影响细胞生长。2、气升式发酵罐借助在环流管底部的喷嘴将空气以250-300m/s的高速喷入环流管，使气泡分散在培育基中。由于环流管内部的液体溶有大量气泡，其密度明显小于反应器主体中培育液的密度。借助密度差使培育液作循环式运动，把反应主体中由于菌体代谢而溶氧量低的培育液送入环流管，待培育液补充氧气后再送回反应主体，从而为菌体生长供应良好足够的氧气供应。内环流式外环流式23471856 1 入口入口 2 空气管空气管 3 上升管上升管 4 冷却夹管冷却夹管 5 压力表压力表 6 罐体罐体 7 气升管气升管 8 排气阀排气阀特点优点：无搅拌装置，借助培育液的密度差完成液体的循环节能和降低了设备成本。缺点：不适于黏度大或含有大量固体的培育液中应用。3、塔式发酵罐利用通入培育液的无菌空气泡上升来带动液体运动，产生混合效果的非机械搅拌式发酵罐。Hd1234H:D=7:1H:D=7:11 进料口进料口 2 进气口进气口 3 出料口出料口 4 排气口排气口特点优点：结构简洁，造价低；削减了剪切对细胞的破坏。缺点：罐体较高，须要安装在室外，适用范围较小。其次节动物细胞生物反应器由于动物细胞体外培育具有明显的表达产物的优点，为传统微生物发酵所无法取代，因此，生物技术中很多有价值的生物制品，须要借助于动物细胞培育而获得，这种需求极大地促进了动物细胞培育技术的发展。大规模的动物细胞培育起先于本世纪50年头，经过多年来的探讨，人类对动物细胞培育技术进行了大量的探讨开发，取得了很大的进展。疫苗人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P、450、纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等动物细胞培育与微生物培育的不同点动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境实力差；对养分要求严格；对环境条件敏感；生长速度缓慢，易受微生物污染，培育时须要抗生素；大多数哺乳动物需附着在固体或半固体的表面生长；动植物细胞培育与微生物培育性能的相比项目目哺乳哺乳动物物细胞胞植物植物细胞胞微生物微生物细胞胞大小m悬浮生长营养要求倍增时间h细胞分化环境的敏感性细胞壁产物存在产物浓度（%）产物种类10100可以，多采用贴壁很复杂15100有非常敏感无胞内或胞外低疫苗、激素、抗体、生长因子、免疫调节剂等10100可以，但细胞易聚集复杂15100有限分化敏感有胞内低酶、生物碱、天然色素、有机化合物等110可以简单0.55无一般有胞内或胞外高发酵食品、抗生素、有机化合物、酶等动物细胞培育方法非贴壁依靠性细胞的培育：来源于血液、淋巴组织的细胞，很多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于这一类型，其可接受类似微生物培育的方法进行悬浮培育。贴壁依靠性细胞的培育：大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和很多异倍体体系的细胞属于这一类型，它们须要附着于适量正电荷的固体或半固体的表面上生长。一、气升式细胞培育生物反应器气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中心导流管使得中心导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要接受内循环式，但也有接受外循环式。优点与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温顺而匀整，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于接受干脆喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和养分成分匀整地分布于培育基中。培育工艺接受阶段式系统。在气升式生物反应器中，溶氧的限制可以通过自动调整进入空气的速率来实现；pH值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来限制。气升式反应器和传统培育方法的抗体产率比较 细胞系细胞系抗体类抗体类型型抗体产量，抗体产量，mm/l气升式气升式/传统传统培养瓶滚瓶气升式气升式1IgG1420865.12IgM701272953.03IgG910737.74IgG28301003.45IgG60762603.86IgM20251125.07IgG30382005.98IgG1201003503.2二、中空纤维管生物反应器中空纤维管生物反应器既可培育悬浮生长的细胞，又可培育贴壁依靠性细胞，细胞的密度最高可达109/ml数量级。假如限制系统不受污染，能长期运转。纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培育基纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长。细胞接种于外室，贴附在纤维外壁，吸取从内室渗透出来的养分成分，生长繁殖。细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避开了对细胞的毒性。中空纤维反应器是仿照了生物体内毛细血管系统，应用广泛，已进入工业生产，主要用于培育杂交瘤细胞生产单克隆抗体。生生长的的细胞型胞型杂交瘤细胞、淋巴细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、胚胎细胞、乳腺组织细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、成纤维细胞、垂体肿瘤细胞、CHO细胞、BHK-2细胞、肺细胞等分泌的分泌的产物物IgG、IgM、IgA、干扰素、激素、尿激酶、蛋白质C、病毒蛋白、乙型肝炎表面抗原、T抑制因子、促细胞生长素、白细胞介素等优缺点优点：占地小，产量和质量高，成本低。不足：不能重复运用，不耐高压灭菌，只能用环氧乙烷等消毒剂灭菌，不能取样检测。三、通气搅拌生物反应器其结构与微生物发酵罐相像。主要区分：较低的高径比，满足细胞对溶解氧的需求；低搅拌转速，大幅倾斜度桨叶或无桨，避开机械损害；圆形罐底，防止细胞及载体沿体壁的沉积。四、流化床生物反应器细细胞胞固固定定在在多多孔孔微微载载体体中中，培培育育基基以以适适当当的的流流速速自自下下而而上上经经过过，使使多多孔孔载载体处于悬浮的流态的反应器。体处于悬浮的流态的反应器。上上部部微微载载体体依依靠靠沉沉降降作作用用与与培培育育基基分分别别，一一部部分分培培育育基基被被收收集集，提提取取产产物物，同同时时排排出出部部分分废废物物；其其余余部部分分再再流流加加等等体体积积新新培培育育基基，供供应应养养分分，实实现现高高密度培育。密度培育。这这种种反反应应器器结结构构比比较较简简洁洁，传传质质性性能能好好，接接受受膜膜气气体体交交换换器器，能能快快速速供供应应氧气。氧气。培育液通过反应器垂直向上循环流淌不断供应应细胞必要的养分成分，同时，不断地加入簇新的培育液，并不断地解除培育产物或代谢产物。流化床生物反应器既可用于贴壁依靠性细胞的培育，又可用于非贴壁依靠性细胞的培育。气体交换气体交换氧气氧气回流回流收获收获养分液养分液泵泵反应塔反应塔加热器加热器PH传感器传感器TDOCO2五、细胞培育的操作方式1、分批式操作已用于搅拌式反应器或气升式反应器培育杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。分批培育杂交瘤和骨髓瘤细胞的周期为35天，细胞密度达25105/ml，最大比生长速率大约为0.05h-1。单克隆抗体的产量约10100mg/L。在大规模搅拌反应器中，细胞密度较低，最终达5106，而在7501500cm2的转瓶生产中，细胞密度达12108。2、流加式操作最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。通过流加限制，可实现高密度培育。杂交瘤细胞培育，细胞密度可达1.4107，生产抗体的产量比分批操作提高几10倍，可达500mg/L。由于培育体积不断变更，流加对过程的限制实力仍旧有限在实际生产中应用少。3、半连续式操作动物细胞培育生产药物中常常接受。已应用于大规模生产乙肝表面抗原、tPA等基因工程产物。微载体系统培育基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后，反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。该方式操作简洁，使细胞密度和产量维持在较高水平，能在较长时间内进行持续生产，反复收获产物，生产效率高，是动物细胞培育生产药物中常常被接受的方式。4、连续式操作不断收获产物，生产中用于非贴壁依靠性细胞培育。连续操作的培育条件稳定，抗体处于最佳生产状态，抗体的生产可维持几个星期甚至几个月。可精确限制最优化参数，产率较高，但必需限制培育基的流加速度和液位高度。5、灌流式操作细胞被截留在反应器内的连续操作，是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式。用簇新的培育液进行连续灌注，通过调整灌注速度，可以把培育过程维持废代谢产物处于抑制水平状态以下。流化床包埋培育人鼠杂交瘤细胞，整个反应器有效浓度达4108/ml，单位体积产量提高200300倍。液位限制液位限制细细胞胞悬悬液液细细胞胞簇新培育基簇新培育基收液收液过滤器过滤器细胞培育系统细胞培育系统优点大大提高了细胞生长密度和产物浓度。利用培育基，降低细胞代谢废物，细胞生长良好。产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避开了产物的聚合、降解等产量和活性形式的变更，有利于纯化。中空纤维生物反应器、固定床或流化床反应器、膜生物反应器等操作方式。缺点：要求困难仪器设备限制灌流操作过程。不同培育方式对不同培育方式对CHO细胞生产人组织血纤细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（维溶酶原激活剂（tPA)产量和活性的影响。产量和活性的影响。细胞培养方式胞培养方式分批培养分批培养半半连续培养培养灌注培养灌注培养纯化利率，%82165纯化物质的相对产量11.337.74比活性，IU/mgtPA114.4391.3392.6第三节植物细胞生物反应器植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发觉的植物自然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发觉1600种的速度递增。李时珍的本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前仍约25%的法定药品来自植物。植物生长缦慢，即使是大规模人工栽培仍旧不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。很多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足须要。植物细胞培育是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培育基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培育使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。植物细胞培育历史1902年，德国植物学家G.Haberlandt就预言植物细胞培育的可能性。1937年前后，法国和美国科学家分别成功的进行了胡萝卜和烟草的组织培育。1966年Klein指出，能利用植物细胞培育物代替收集或栽培植株来生产生化制品。近40年来，植物细胞培育探讨成功的例子已有不少，如用紫草悬浮培育物生产紫草宁；烟草细胞的大量培育等等。与微生物相比，植物细胞具有的特性细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，抗剪切实力低；与动物细胞培育类同，生长速率慢，为防止培育过程中染菌，需加抗生素；细胞培育需氧，而培育液粘度大，且不能强力通风搅拌；产物在细胞内且产量低；细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培育的难度等。生物种生物种类 (h-1)平均平均时代代时间(h)烟草0.0320.0421.717.3番茄0.0140.02649.526.7人参0.02133.0酿酒酵母0.50.651.391.07红曲霉0.1255.54植物与微生物细胞生长速率的比较植物与微生物细胞生长速率的比较目前，植物细胞培育技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。我国在“八五”、“九五”和“863支配”中连续拨款资助工业化培育红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的探讨，目前已达到60mg/L的世界先进水平。植物细胞培育设备机械搅拌反应器气升式反应器填充床反应器流化床反应器膜反应器螺线式卷绕膜反应器细胞细胞营养物入口营养物入口营养物出口营养物出口营养物质营养物质b-螺线式卷绕反应器螺线式卷绕反应器