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核医学分子核医学本讲稿第一页，共二十四页定义：分子生物学与实验核医学结合定义：分子生物学与实验核医学结合。内内涵涵：利利用用示示踪踪技技术术观观察察体体内内的的生生化化过过程程并并与与相相关关基基因因联联系系起起来来的的一一门门分分支支学学科科，分分子识别子识别是其重要理论基础。是其重要理论基础。研究领域：受体显像研究领域：受体显像基因显像基因显像重重组组单单抗抗片片段段、肽肽类类放放射射性性药药物物及微型抗体。及微型抗体。本讲稿第二页，共二十四页特点：特点：1）深深入入分分子子水水平平认认识识疾疾病病，通通过过细细胞胞信信息息传传导导、基基因因表表达达、生生化化代代谢谢等等多多个个方方面面，在在解解剖剖学学和和功功能能症症状状出出现现之之前前发发现现病病变变信信息。息。2）通通过过特特定定示示踪踪剂剂，将将疾疾病病与与基基因因表表达达的的改变联系起来，提高疾病诊治的层次。改变联系起来，提高疾病诊治的层次。3）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。）当代分子生物学研究成果是其理论源泉。4）分子识别是分子核医学的理论基石。）分子识别是分子核医学的理论基石。5）生化代谢的评价是其理论重要组成部分。）生化代谢的评价是其理论重要组成部分。本讲稿第三页，共二十四页二、当前的几个热门研究领域（六个领域）二、当前的几个热门研究领域（六个领域）1、受体显像：举例、受体显像：举例a、b、c2、受体介导的放射配体治疗、受体介导的放射配体治疗3、放免显像（、放免显像（RII）4、放免治疗（、放免治疗（RIT）5、基因显像和基因放射治疗、基因显像和基因放射治疗原原理理：将将放放素素标标记记的的反反义义寡寡核核苷苷酸酸注注入入受受试试者者体体内内，由由于于体体内内癌癌基基因因等等有有过过度度表表达达，通通过过体体内内核核酸酸分分子子杂杂交交而而与与相相应应靶靶基基因因结结合合，以以定定位位、定定量量显显示示特特异异靶靶基基因因，从从而而进进行行基基因因诊诊断断以以及及破破坏坏相相应应致致病病基基因因而达到治疗的目的。而达到治疗的目的。本讲稿第四页，共二十四页反义寡核苷酸基因显像剂的特点：反义寡核苷酸基因显像剂的特点：1）分子量小）分子量小4）无免疫原性）无免疫原性2）穿透力强）穿透力强5）与靶结合快）与靶结合快3）特异性高）特异性高 6）靶）靶/非靶比值高非靶比值高反义寡核酸的基本要求：反义寡核酸的基本要求：P303基因显像必备条件：基因显像必备条件：1）胞浆中必须有足够的）胞浆中必须有足够的mRNA基因产物基因产物标记反义探针必须与靶细胞特异选择性结合并保持稳定。标记反义探针必须与靶细胞特异选择性结合并保持稳定。本讲稿第五页，共二十四页6、代谢显像：主要指、代谢显像：主要指PET显显像像原原理理：+衰衰变变的的放放素素与与体体内内靶靶物物质质作作用用而而损损失失能能量量被被吸吸收收、转转化化为为二二个个方方向向相相反反的的高高能能r光光子子。它它提提供供了了很很好好的的空空间间定定位位信信息息，经经计计算算机机处处理理重重新新购购成成清清晰晰的的三三维维图像。图像。本讲稿第六页，共二十四页+核素特点：核素特点：1)大部分为人体基本元素，全部为人工生产大部分为人体基本元素，全部为人工生产2)湮灭辐射可获得三维图像湮灭辐射可获得三维图像3)T1/2短，一次可给较大剂量，图像清晰短，一次可给较大剂量，图像清晰4)重复给药，动态观察。重复给药，动态观察。临床应用举例：临床应用举例：18F-萄萄糖糖研研究究脑脑功功能能状状况况，老老年年痴痴呆呆时时摄摄取取18F-萄萄，测脑部放射性下降。，测脑部放射性下降。脑瘤区脑瘤区18F-萄萄。本讲稿第七页，共二十四页三、分子生物学中的示踪技术及应用三、分子生物学中的示踪技术及应用P271（一一）核核酸酸标标记记：标标记记上上放放射射性性核核素素的的又又叫叫探探针针，或或叫基因探针。叫基因探针。1、探针分类：基因组、探针分类：基因组DNA探针探针 CDNA探针探针以以mRNA为模板为模板CRNA探针探针反向合成的反向合成的DNA片段片段人工合成寡核人工合成寡核探针的标记物分类探针的标记物分类放素：放素：32P33P35S3H14C125I等等非放：生物素、地高辛等。非放：生物素、地高辛等。本讲稿第八页，共二十四页两类探针的比较：两类探针的比较：放素探针放素探针非放探针非放探针灵敏度高、应用广灵敏度高、应用广对对人人体体有有害害、寿寿命命短短灵灵敏敏度度低低，对对核核酸酸分分子子有有修修饰饰作作用用，但但无无放射危害，寿命长放射危害，寿命长六种常用的放素的性质、特点六种常用的放素的性质、特点P273表表111本讲稿第九页，共二十四页2、核酸探针的具体标记方法：、核酸探针的具体标记方法：体体内内标标记记：将将32P磷磷酸酸盐盐加加到到细细胞胞或或细细菌菌培培养养体体系中，使系中，使32P参入新合成的核酸分子上。参入新合成的核酸分子上。酶酶促促法法体体外外标标记记：很很常常用用，先先将将核核素素预预先先标标记记在在核核苷苷酸酸上上，然然后后利利用用多多种种核核酸酸聚聚合合酶酶将将核核苷苷酸酸参参入入到到探探针分子中或交换到探针分子中去。针分子中或交换到探针分子中去。常见的几种外标记方法：常见的几种外标记方法：1）DNA缺缺口口平平移移法法：已已有有试试剂剂盒盒提提供供如如Amashema,promega,BR2等公司。等公司。2）随机引物法：也有试剂盒上市。）随机引物法：也有试剂盒上市。本讲稿第十页，共二十四页两种方法注意点：两种方法注意点：模板越小，产物的比活度越高；模板越小，产物的比活度越高；产物的长度与加入寡核苷酸引物的量成正比；产物的长度与加入寡核苷酸引物的量成正比；有有5种原因常引起标记碍障：种原因常引起标记碍障：a、DNA双链未充分变性；双链未充分变性；b、DNA纯度不佳；纯度不佳；c、Klenow酶效价不够；酶效价不够；d、DNA片段太少，片段太少，G50分离时丢失；分离时丢失；e、DNA用量过大或过少。用量过大或过少。本讲稿第十一页，共二十四页3）单单链链DNA探探针针标标记记：在在M13噬噬菌菌体体的的环环状状单单链链上上合成互补合成互补DNA链时参入放素。链时参入放素。4）CDNA探探针针标标记记：以以mRNA为为模模板板，在在引引物物和和四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸酸（dNTP，其其中中一一种种为为标标记记物）存在下，经酶促聚合反应合成互补标记物）存在下，经酶促聚合反应合成互补标记CDNA。5）RNA探针标记：探针标记：P2756）DNA探针的探针的5端标记：端标记：P2757）DNA探针的探针的3端标记：端标记：P2768）PCR-DNA标标记记：PCR扩扩增增时时通通过过合合成成DNA将将32P-dNTP参入到参入到DNA分子中达到标记作用。分子中达到标记作用。将将32PdNTP参入到参入到DNA分子中达到标记作用。分子中达到标记作用。本讲稿第十二页，共二十四页3、核酸标记的检测、核酸标记的检测核核酸酸标标记记方方法法很很多多，虽虽已已大大部部分分商商品品化化和和标标准准化化，但但环环节节繁繁杂杂，试试剂剂质质量量及及操操作作等等影影响响因因素素多多，标标记完成后应定性、定量检测。记完成后应定性、定量检测。参入核酸中的参入核酸中的cpm主要两个指标：参入比主要两个指标：参入比=-100%加入的标记品总加入的标记品总cpm比活性：指每微克核酸中的放射性计数比活性：指每微克核酸中的放射性计数cpm/gDNA(RNA)本讲稿第十三页，共二十四页4、核酸标记注意事项：、核酸标记注意事项：1）同位素的安全防护）同位素的安全防护2）核酸原料一般用）核酸原料一般用50-150ng，越少，产品比活度越高。，越少，产品比活度越高。3）标记前体）标记前体32P-dNTP，用时须真空抽干，用时须真空抽干4）使用的）使用的Ependoff管和吸头需先硅化、防止吸附。管和吸头需先硅化、防止吸附。5）标记物应及时用，）标记物应及时用，-20可保存可保存13天天6）严格按厂家说明书操作，最好做预实验。）严格按厂家说明书操作，最好做预实验。7）个别标记方法标记前需做）个别标记方法标记前需做DNA变性处理。变性处理。本讲稿第十四页，共二十四页（二）核酸分子杂交技术（二）核酸分子杂交技术定定义义：具具有有一一定定同同源源性性的的核核酸酸单单链链在在一一定定条条件件下按硷基互补原则形成异源双链的过程。下按硷基互补原则形成异源双链的过程。杂杂交交步步骤骤：核核酸酸探探针针与与核核酸酸样样品品（处处理理好好的的）混混合合反应反应漂洗漂洗ARGor测量测量分析。分析。固相杂交：固相杂交：1）Southern印印迹迹杂杂交交：P277、查查DNA序序列列，分分析析基因结构、并进行定性、定量研究。基因结构、并进行定性、定量研究。步步骤骤：提提取取DNA酶酶解解DNA琼琼脂脂糖糖电电泳泳转转移移硝硝酸酸纤维膜上并固定纤维膜上并固定杂交杂交ARG2）Nothern印印迹迹杂杂交交法法：主主要要查查RNA序序列列，步骤大致同上。步骤大致同上。本讲稿第十五页，共二十四页3）斑斑点点杂杂交交：将将变变性性的的DNAorRN点点样样在在硝硝酸酸纤纤维维膜上，然后杂交，膜上，然后杂交，ARG。4）反反向向斑斑点点杂杂交交：将将多多种种未未标标记记的的已已知知序序列列寡寡核核苷苷酸酸探探针针点点样样于于纤纤维维膜膜，再再将将待待分分析析的的DNA用用放放素素标标记记后后与与其其杂杂交，交，ARG根据杂交点判断根据杂交点判断DNA序列。序列。P2785）菌菌落落、噬噬菌菌斑斑原原位位杂杂交交：将将微微生生物物点点于于纤纤维维素素膜膜或或贴贴印印方方式式转转移移微微生生物物，曝曝露露细细胞胞DNA，硷硷化化DNA变变性性，并固定，再进行斑点杂交过程。并固定，再进行斑点杂交过程。6）组组织织、细细胞胞原原位位杂杂交交：将将组组织织切切片片或或细细胞胞固固定定在在玻玻片上，用已知的标记核酸探针进行杂交。片上，用已知的标记核酸探针进行杂交。特点；不需以细胞中提取特点；不需以细胞中提取DNAorRNA，通过，通过ARG在显在显微镜下观察银颗粒，进行定位、定性研究，定位准。敏感性微镜下观察银颗粒，进行定位、定性研究，定位准。敏感性高，对含量极低的靶序列也可检测。高，对含量极低的靶序列也可检测。本讲稿第十六页，共二十四页注：如原位杂交采用非放探针，可染色显微观察。液相杂交：将变性的单链核酸与探针在溶液中自由杂交，适当方法分离获得杂交分子、测放了解其特定序列的信息。特点：1）受检的目标核酸与示踪的标记核酸均不在支持相上。2）主要用于基因筛选和将基因组中重复的序列与单一序列分离出来。本讲稿第十七页，共二十四页（三）（三）DNA序列分析序列分析DNA序列分析的两个基本步骤序列分析的两个基本步骤DNA片段的制备的扩增片段的制备的扩增测定测定DNA序列序列PCR测测序序分分析析：利利用用一一对对高高特特异异性性引引物物，可可以以直直接接从从基基因因文文库库中中原原始始克克隆隆或或从从极极复复杂杂的的基基因因组组DNA中中，通通过过不不对对称称PCR反反应应制制备备特特定定基基因因片片段段为为测测序序模模板板（单链（单链DNA），然后用），然后用双脱氧法双脱氧法完成序列分析。完成序列分析。双双脱脱氧氧法法指指当当有有双双脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸酸ddNTP参参入入时时，链链的的延延长长就就终终止止，可可以以得得到到一一系系列列长长度度不不同同的的核核酸酸片片段段，由由于于4种种原原料料dNTP中中有有一一种种是是标标记记的的，所所以以可可通通过过ARG，从图上读出被测，从图上读出被测DNA的硷基排列序列。的硷基排列序列。常用方法：未端终止法常用方法：未端终止法化学法化学法P280本讲稿第十八页，共二十四页（四）重组（四）重组DNA和基因工程和基因工程重重组组DNA基基因因克克隆隆（基基因因工工程程）：指指采采用用分分子子生生物物学学技技术术在在试试管管内内有有目目的的地地切切割割分分离离纯纯化化或或人人工工合合成成的的DNA分分子子和和相相应应的的载载体体，并并将将其其拼拼接接成成重重组组DNA后后导导入入合合适适的的宿宿主主细细胞胞中中，使使之之大大量量扩扩增增形形成成克克隆隆，并并表达基因产物。表达基因产物。基因工程的基本步骤：基因工程的基本步骤：P282了解了解与与核核医医学学相相关关技技术术基基因因诊诊断断：核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术中中用用的的放放素素，主主要要包包括括遗遗传传性性疾疾病病、癌癌基基因因与与抗抗癌癌基基因因的的研究。研究。（五）聚合酶链反应（五）聚合酶链反应PCRP284了解了解（六）蛋白质合成中的核技术应用（六）蛋白质合成中的核技术应用P287了解了解本讲稿第十九页，共二十四页（七）半抗原标记及其应用：（七）半抗原标记及其应用：P215半抗原：定义不能诱导产抗体，但能反应半抗原：定义不能诱导产抗体，但能反应。应应用用原原理理：将将半半抗抗原原看看作作为为放放素素去去标标记记核核酸酸或或抗抗体体，激激素素等等分分子子（方方法法已已趋趋成成熟熟）。然然后后把把能能与与半半抗抗原原结结合合的的相相应应抗抗体体用用荧荧光光素素、酶酶或或胶胶体体金金标标记记上上，然然后后作作示示踪踪研研究究，通过测荧光素或显色反应进行定位和定性研究。通过测荧光素或显色反应进行定位和定性研究。本讲稿第二十页，共二十四页举例：举例：（1）地高率半抗原标记：将地高率通过一个）地高率半抗原标记：将地高率通过一个“联结臂联结臂”结在结在duTP上，再用随机引物法或其它上，再用随机引物法或其它酶反应方法将酶反应方法将DIGduTP掺入到核酸上，反应完后掺入到核酸上，反应完后用碱性磷酸酶标记的抗用碱性磷酸酶标记的抗DIG抗体去结合，而该酶可抗体去结合，而该酶可显色反应。显色反应。*）而胶体金即为氯化金分子呈胶体态粉红）而胶体金即为氯化金分子呈胶体态粉红色，具有高电子密度和能与大分子物质结合的特征，色，具有高电子密度和能与大分子物质结合的特征，可在电镜，光镜下进行定性，定位研究。可在电镜，光镜下进行定性，定位研究。2）二硝基苯或三硝基苯（）二硝基苯或三硝基苯（DNP或或TNP）半抗原标记：它可标蛋白、激素、抗体等。示踪过程半抗原标记：它可标蛋白、激素、抗体等。示踪过程酶显色。酶显色。本讲稿第二十一页，共二十四页（八）免疫（八）免疫PCR技术：技术：P216定义：定义：PCR+Ag-Ab结合反应的新技术。结合反应的新技术。原原理理：DNA作作为为标标记记物物（看看做做放放素素），最最后后可可用用PCR将将DNA扩扩增增，通通过过测测定定DNA的的量量进进行行定定性性研研究的一种方法。究的一种方法。基本反应：基本反应：1）将待测抗原固化试管底部）将待测抗原固化试管底部2）加入生物素标记的特异抗体）加入生物素标记的特异抗体Ab-b3）加入亲和素）加入亲和素A作为连接分子作为连接分子Ag+Ab-b+AAgAb-b-A4）每加入生物素标记的）每加入生物素标记的DNA-b本讲稿第二十二页，共二十四页得得Ag+Ab-b-A+DNA-bAgAb-b-A-b-DNA引物引物PCR扩增扩增染色染色记录记录PCR扩增的扩增的DNA量。量。特点（优点）：特点（优点）：1）特异性强（与）特异性强（与RIA相同）相同）2）灵敏度高（比酶标高）灵敏度高（比酶标高1000倍，也高于倍，也高于RIA）3）操作简单）操作简单缺点：缺点：1）假阳性高）假阳性高2）影响实验的因素多）影响实验的因素多3）未商品化。）未商品化。本讲稿第二十三页，共二十四页本讲稿第二十四页，共二十四页