菌种选育.ppt

菌种菌种选育育第一节第一节 微生物的特性及工业微生物的要求微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性v 有些微生物能在厌氧的条件下生长；v 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长；v 有些微生物能进行复杂的代谢；v 有些微生物能利用较复杂的化合物；v 有些微生物能在极端的环境下生长。二：工业化菌种的要求二：工业化菌种的要求v 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；v 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；v 遗传性能要相对稳定；v 不易感染它种微生物或噬菌体；v 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；v 生产特性要符合工艺要求。放线菌（链霉素、四环素、红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：第二节第二节 已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：HD:HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制 HT:HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单。谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌。常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌。三、食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌四、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌、沙门氏菌u生长迅速、蛋白产量高;u表达蛋白的纯化、分离及分析快速；u外源基因的导入相对容易；u已建立了整套表达理论及技术.(二)真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)u 生长迅速，营养要求不高，易培养；u安全性好；u比哺乳动物细胞操作简单；u具有一定的修饰蛋白的能力。中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统u 具有准确的转录后修饰功能；u 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；u 具有重组基因的高效扩增和表达能力；u 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；u CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来礼来(Eli lilly),(Eli lilly),花了花了1010年的时间从年的时间从4040万株微生物中，发现了三种有潜力的万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。新抗生素。例：u根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏 部门索取或购买；u从大自然中分离筛选新的微生物菌种。第三节 菌种的来源一、菌种的来源二、分离思路二、分离思路二、分离思路二、分离思路 uu新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种筛筛选选方方法法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。uu实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。uu有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。uu定方案：定方案：定方案：定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。uu采样：采样：采样：采样：有针对性地采集样品。有针对性地采集样品。uu增殖增殖增殖增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。uu分离：分离：分离：分离：利用分离技术得到纯种。利用分离技术得到纯种。uu发酵性能测定发酵性能测定发酵性能测定发酵性能测定：进行生产性能测定。进行生产性能测定。这这些些特特性性包包括括形形态态、培培养养特特征征、营营养养要要求求、生生理理生生化化特特性性、发发酵酵周周期期、产产品品品品种种和和产产量量、耐耐受受最高温度、生长和发酵最适温度、最适最高温度、生长和发酵最适温度、最适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤三、新种分离与筛选的步骤菌种筛选主要步骤：菌种筛选主要步骤：调查研究及查阅充分的资料调查研究及查阅充分的资料 设计实验方案设计实验方案 确定采集样品的生态环境确定采集样品的生态环境 采样采样 确定特定的增殖条件确定特定的增殖条件 增殖培养增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法定性或半定量快速检出法 平板平板分离分离分离分离 原种斜面原种斜面 确定发酵培养基础条件确定发酵培养基础条件 筛选筛选 初筛（初筛（1 1株株1 1瓶）瓶）复筛（复筛（1 1株株3 35 5瓶）瓶）结合初步工艺条件摸索结合初步工艺条件摸索 再复筛（再复筛（1 1株株3 35 5瓶）瓶）3 35 5株株 单株纯种单株纯种分离分离分离分离 生产性能试验生产性能试验 毒性试验毒性试验 菌种鉴定菌种鉴定 （一）采样一）采样一）采样一）采样1 1、采样对象、采样对象 以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。以采集土壤为主。包括极端环境中的微生物类群。uu一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如 一些野果生长区和果园内。一些野果生长区和果园内。uu采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选从自然界筛选 2 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3 3、采采土土方方式式：在在选选好好适适当当地地点点后后，用用小小铲铲子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-15cm5-15cm处处的的土土约约10g10g，盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好好，标标记记，记记录录采采样样时时间间、地地点点、环环境境条条件件等等，以以备备查查考考。为为了了使使土土样样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。（二）增殖（富集）培养（二）增殖（富集）培养（二）增殖（富集）培养（二）增殖（富集）培养 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择性培养基，选择一定的培养条件来控制择性培养基，选择一定的培养条件来控制富集培养。富集培养。例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选定定糖糖，淀淀粉粉、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这这样样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。对下阶段的纯种分离就会顺利得多。富集的三种方案：u 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。目的微生物富集的一些基本方法目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。u 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，u 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法定向培养的方法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等.如放线菌材料预处理。但主要是通过培养的方法。定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）80度30分钟处理文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落。从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72-Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落目的微生物富集方法的研究进展 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等。目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。2002,陈文新（科学院院士）（三）培养分离（三）培养分离（三）培养分离（三）培养分离 尽尽管管通通过过增增殖殖培培养养效效果果显显著著，但但还还是是处处于于微微生生物物的的混混杂杂生生长长状状态态。因因此此还还必必须须分分离离，纯纯化化。在在这这步步，增增殖殖培培养养的的选选择择性性控控制制条条件件还还应应进进一一步步应应用用，而而且且控控制制得得细细一一点点，好好一一点点。纯纯种种分分离离的方法有划线分离法、稀释分离法。的方法有划线分离法、稀释分离法。1.稀释平皿分离法1.稀释平皿分离法99ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 释1.稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法2.平皿划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法 菌落的选出菌落的选出从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基；利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素。从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。在要求获得高产菌株的同时，还应考虑推广到生产过程时的经济问题，在筛选所需菌株时宜考虑的一些重在要求获得高产菌株的同时，还应考虑推广到生产过程时的经济问题，在筛选所需菌株时宜考虑的一些重在要求获得高产菌株的同时，还应考虑推广到生产过程时的经济问题，在筛选所需菌株时宜考虑的一些重在要求获得高产菌株的同时，还应考虑推广到生产过程时的经济问题，在筛选所需菌株时宜考虑的一些重要指标：要指标：要指标：要指标：1.1.菌的营养特征；菌的营养特征；菌的营养特征；菌的营养特征；2.2.菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于菌的生长温度应选择温度高于4040度的菌种；度的菌种；度的菌种；度的菌种；3.3.菌对所采用的设备和生产过程的适应性；菌对所采用的设备和生产过程的适应性；菌对所采用的设备和生产过程的适应性；菌对所采用的设备和生产过程的适应性；4.4.菌的稳定性；菌的稳定性；菌的稳定性；菌的稳定性；5.5.菌的产物得率和产物在培养液中的浓度；菌的产物得率和产物在培养液中的浓度；菌的产物得率和产物在培养液中的浓度；菌的产物得率和产物在培养液中的浓度；6.6.容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。容易从培养液中回收产物。（四）筛（四）筛（四）筛（四）筛 选选选选 这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的的容容量量进进行行小小型型发发酵酵试试验验，以以求得适合于工业生产用菌种。求得适合于工业生产用菌种。（五）毒性试验（五）毒性试验（五）毒性试验（五）毒性试验 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。目的微生物培养分离目的微生物培养分离目的微生物培养分离目的微生物培养分离uu从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。uu到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。uu在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的菌菌株株；在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程程中中，应应及及时时调调整整检检测测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。uu因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。1 1、成功的分离培养方法、成功的分离培养方法、成功的分离培养方法、成功的分离培养方法(1)(1)认真考查所需产品的特征和生产过程；认真考查所需产品的特征和生产过程；(2)(2)制订初步的筛选标准；制订初步的筛选标准；(3)(3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。将生态学方法运用到分离和筛选过程。2 2、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点、将生态学方法用于培养分离的一般思路要点1 1罗列出所要分离的微生物类群；罗列出所要分离的微生物类群；2 2根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：根据所采集样本的各种生态参数，描述所要分离的微生物之生态系统或栖息地：3 3将将若若干干样样本本分分成成若若干干类类型型，如如植植物物和和植植物物各各部部，土土壤壤(类类型型和和土土层层)、岩岩石石、水水、昆昆虫虫和和发发酵酵食食品等；品等；4 4罗列出所要考察和测量的环境参数，如罗列出所要考察和测量的环境参数，如pHpH、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；、盐分、水分、氧化还原电势及温度等；5 5列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；列出生物系统中有用的自然底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；6 6根据上述根据上述1-51-5项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；培养条件；7 7用标准方法作对照来评价生态学分离方法；用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8 8根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；9 9运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。(一一一一)采样和采集方法采样和采集方法采样和采集方法采样和采集方法 为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中中出出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子子、解解剖剖刀刀、手手套套、无无菌菌小小塑塑料料袋袋和和塑塑料瓶等。料瓶等。细菌的分离细菌的分离采样的注意事项采样的注意事项采样的注意事项采样的注意事项1 1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；2 2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及 采集地点的地理、生态参数等；采集地点的地理、生态参数等；4 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群 的出现可能是短暂的；的出现可能是短暂的；5 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于44下，但下，但 贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生 变化，微生物群体之间就会出现消长。变化，微生物群体之间就会出现消长。(二二二二)生态学参数及培养基的组成原则生态学参数及培养基的组成原则生态学参数及培养基的组成原则生态学参数及培养基的组成原则1 1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以及及用用于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都都会会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2 2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成而而言言，部部分分培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3 3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为，掺加浓度一般为50g50gm1m1，以抑制真以抑制真菌的生长。菌的生长。4 4、琼脂平板在使用前应置于、琼脂平板在使用前应置于3737培养箱中孵育培养箱中孵育l l、2 2天。天。5 5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。二、二、分离分离分离分离 目的微生物不纯，需目的微生物不纯，需分离分离分离分离纯化。采用简便迅速，有一定准确纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：uu纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。：浸有指示剂滤纸。uu透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。uu变色圈法变色圈法变色圈法变色圈法：直接用显色剂或指示剂。：直接用显色剂或指示剂。uu生长圈法生长圈法生长圈法生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离分离分离分离的微生物能在一般培养条件下的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。uu抑制圈法抑制圈法抑制圈法抑制圈法：琼脂块培养法。：琼脂块培养法。用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株 羧甲基纤维素钠作培养物羧甲基纤维素钠作培养物抗生素筛选抗生素筛选检定菌培养，加上发酵液检定菌培养，加上发酵液放线菌的分离培养基的组成原则放线菌的分离培养基的组成原则放线菌的分离培养基的组成原则放线菌的分离培养基的组成原则uu大大多多数数放放线线菌菌的的分分离离培培养养是是在在贫贫脊脊或或复复杂杂底底物物的的琼琼脂脂平平板板上上进进行行的的。除除嗜嗜温温性性放放线线菌菌外外，其其他他放放线线菌菌一般在培养一般在培养4-204-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。天内在分离平板上缓慢形成菌落。uu在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。uu选择性地添加抗生素。选择性地添加抗生素。uu分离琼脂平板制备好后，一般皆应在分离琼脂平板制备好后，一般皆应在3737培养箱中存放培养箱中存放3 3天。天。放线菌的分离放线菌的分离uu土样中放线菌的非选择性分离：土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。uu植物体上放线菌的分离：植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。物后振荡培养。uu水中放线菌的分离：水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。沉积进行系列稀释和涂布。放线菌的分离放线菌的分离次代培养及纯化次代培养及纯化次代培养及纯化次代培养及纯化uu菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。uu通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。uu成成功功地地分分离离出出各各种种不不同同的的放放线线菌菌属属及及种种的的关关键键是是所所采采集集样样本本的的本本身身及及其其分分离离用用的的琼琼脂脂培培养养基基；而而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时显得尤为重要。uu将将分分离离平平板板上上所所形形成成的的菌菌落落用用经经火火焰焰灼灼烧烧灭灭菌菌的的钩钩形形针针或或无无菌菌牙牙签签挑挑取取，点点接接到到琼琼脂脂平平板板上上进进行行影印培养，以进一步筛选和分离。影印培养，以进一步筛选和分离。放线菌菌落形态放线菌菌落形态真菌分离真菌分离真菌分离真菌分离1 1、利利用用低低碳碳氮氮比比的的培培养养基基可可使使真真菌菌生生长长菌菌落落分分散散，利利于于计计数数，分分离离和和鉴鉴定定。这这里里主主要要是是利利用用营营养养成成分分的的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁徙生长。减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁徙生长。2 2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3 3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。4 4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5 5、在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。、在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法真菌的分离方法真菌的分离方法真菌的分离方法uu土土中中真真菌菌的的分分离离：稀稀释释法法，混混入入法法，压压贴贴法法，粘粘附附法法，浮浮选选法法，注注射射器器采采集集法法，土土过过筛筛法法，庶庶糖糖密密度度梯梯度离心法。度离心法。uu植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。uu水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。uu子子实实体体直直接接分分离离培培养养担担子子菌菌：新新采采集集的的子子实实体体组组织织植植入入平平板板内内或或在在放放于于液液体体培培养养基基表表面面放放一一小小块块无无菌菌滤滤纸上培养。纸上培养。第四节第四节 菌株选育、分子改造菌株选育、分子改造目的:u 提高生产能力提高生产能力u 提高产品质量提高产品质量u 开发新产品开发新产品u 解决生产实际问题解决生产实际问题u 防止菌种退化防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等.自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况：自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。一、自然选育一、自然选育自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变。问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落 (注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验二、诱变育种二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种.诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂.诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题u 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性u诱变剂量的选择诱变剂量的选择u诱变剂的选择诱变剂的选择u出发菌株的选择出发菌株的选择（一）诱变剂的作用原理（略）（一）诱变剂的作用原理（略）压硝酸：压硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亚硝基胍：亚硝基胍：1MNaOH1MNaOH（三）诱变育种的一般步骤（三）诱变育种的一般步骤(p38)原始菌种原始菌种纯化纯化斜面斜面/肉汤培养肉汤培养单孢子单孢子/单细胞悬液单细胞悬液诱变剂处理诱变剂处理平板分离平板分离移至斜面移至斜面小试小试中试中试初筛初筛复筛复筛计算存活率计算存活率观察形态变异，挑单菌观察形态变异，挑单菌落落良种保藏良种保藏原菌种特性鉴定原菌种特性鉴定1.出发菌株的选择：出发菌株用来育种处理的起始菌株.出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力；出发菌株的来源；自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株：诱变育种工作中几个应注意的问题诱变处理方式：诱变处理方式：u单一因子处理：单一因子处理：u复合因子处理：复合因子处理：u两种以上因素两种以上因素先后使用先后使用 同时使用同时使用 单一因子重复使用单一因子重复使用2.复合诱变因素的应用剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70-80%）3.剂量选择4.变异菌株筛选变异菌株筛选(1)平皿快速检测法平皿快速检测法l变色圈法变色圈法l透明圈法透明圈法l生长圈法生长圈法l抑菌圈法抑菌圈法l梯度平板法梯度平板法(2)摇瓶培养法摇瓶培养法以温度敏感突变为例：以温度敏感突变为例：筛选方法：筛选方法：用途：常用于提高代谢物产量用途：常用于提高代谢物产量原原因因：是是由由于于某某一一酶酶蛋蛋白白结结构构改改变变后后，在在高高温温下下活活力丧失力丧失重重要要性性：如如果果此此酶酶为为蛋蛋白白质质、核核酸酸合合成成途途径径中中所所需需的的酶酶，则则此此变变异异株株在在高高温温下下的的表表型型就就是是营营养养缺缺陷型。陷型。条件抗性突变型的筛选条件抗性突变型的筛选举例：举例：u由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌由谷氨酸产生菌乳糖发酵短杆菌2256，经诱变处理得到温度敏感变异株，经诱变处理得到温度敏感变异株Ts88:u30培养时能正常生长培养时能正常生长;u40是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反是死亡，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸（而野生型却受生物素的反馈抑制）。馈抑制）。u在富含生物素的培养基中进行发酵时：在富含生物素的培养基中进行发酵时：u先在先在30（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（允许条件）中进行培养以得到大量菌细胞，适当时间后提高温度（40，非，非允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。允许条件），即能获得谷氨酸的过量生产。方法：梯度平板法（方法：梯度平板法（方法：梯度平板法（方法：梯度平板法（gradient plategradient plate）抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选抗药性突变株的应用：抗药性突变株的应用：u作为菌株的遗传标记作为菌株的遗传标记u作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）作为生产菌种（结构类似物抗性变异株）产量变异株的筛选：产量变异株的筛选：营养缺陷型营养缺陷型auxo诱变筛选步骤及方法诱变筛选步骤及方法auxoauxo的鉴定的鉴定的鉴定的鉴定 诱变处理诱变处理auxo的浓缩的浓缩auxo的检出的检出营养缺陷型营养缺陷型(auxotroph)的筛选的筛选缺陷型缺陷型的浓缩：的浓缩：抗生素法抗生素法原理：原理：青青霉霉素素、制制霉霉菌菌素素等等抗抗生生素素作作用用于于生生长长着着的的微微生生物物细细胞胞，对对休休止止态态细细胞无作用。胞无作用。方法：方法：将菌培养在含抗生素的将菌培养在含抗生素的MM基中。基中。菌丝过滤法菌丝过滤法u适用于：丝状（放线菌、霉菌）适用于：丝状（放线菌、霉菌）u原理：基本培养基上只有发育成菌丝；原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。逐个检出法：逐个检出法：缺陷型缺陷型的检出：的检出：影印平板培养法影印平板培养法夹层培养法夹层培养法夹层培养法夹层培养法生长谱法方法简便；回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片 缺陷型缺陷型的鉴定：的鉴定：测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；组合营养物法：组合营养物法：步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：步骤（以氨基酸缺陷型的鉴定为例）：a.将多种营养因子编组；将多种营养因子编组；b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养；c.结果分析；结果分析；如：如：一组：一组：1 2 3 4 5 二组：二组：2 6 7 8 9 三组：三组：3 7 10 11 12 四组：四组：4 8 11 1313 14 五组：五组：5 9 12 14 15营养因子分组编排时注意：营养因子分组编排时注意：1）每组内无重复的营）每组内无重复的营 养因子养因子 2）每组中应包含只出）每组中应包含只出 现一次的因子现一次的因子 3）每组中其他因子应）每组中其他因子应 分别出现二次分别出现二次 一组：一组：1 2 3 4 5 二组：二组：2 6 7 8 9 三组：三组：3 7 10 11 12 四组：四组：4 8 11 1313 14 五组：五组：5 9 12 14 15组合补充培养基法：组合补充培养基法：将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的将待测的菌点种到各种补充培养基上，逐个分析各菌的缺陷缺陷类型，或快速分离出所需类型，或快速分离出所需缺陷缺陷类型的菌株。类型的菌株。ABFEDCHG三、抗噬菌体菌株的选育三、抗噬菌体菌株的选育三、抗噬菌体菌株的选育三、抗噬菌体菌株的选育1、噬菌体的分布：、噬菌体的分布：噬菌体广泛分布在自然界，存在于土壤、肥料、粪便和污水中。u从外科病房病人疮口脓液中容易找到金黄色葡萄球菌噬菌体，u从受细菌病害的植株上亦可分离到噬菌体。u在工厂生产中，对排出的菌体如不及时处理，便有可能在下水道 的污水和四周土壤中滋生噬菌体，u在情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体。u总之，凡是有寄主细胞的地方，一般容易找到它们的噬菌体。2.2.抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育uu在工业微生物发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。在工业微生物发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。uu在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。uu由于噬菌体很易发生变异，因此又会出现新的噬菌体，对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。由于噬菌体很易发生变异，因此又会出现新的噬菌体，对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。uu所以既要不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常进行。所以既要不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常进行。（1 1）抗噬菌体菌株选育的几种方法）抗噬菌体菌株选育的几种方法）抗噬菌体菌株选育的几种方法）抗噬菌体菌株选育的几种方法 a a自然突变以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自自然突变以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株，这种方法获得的抗性突变频率很低。然突变为抗性菌株，这种方法获得的抗性突变频率很低。b b诱发突变敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分诱发突变敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上。经诱变后的存活孢子离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上。经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与正常菌落的生长速度相近，诱变可以提高抗牲菌株的频率度一般与正常菌落的生长速度相近，诱变可以提高抗牲菌株的频率 除上述方法外，还可将敏感菌孢子经诱变后接入种子培养基，