海绵相关的微生物群落的多样性和生物技术潜能.ppt

海绵相关的微生物群落的多样性和生物技术潜能海绵相关的微生物群落的多样性和生物技术潜能 刘杰刘杰 10808076汕头大学多学科研究中心海洋占地球表面积的71%，体积占生物圈的95。蕴藏着极为丰富的生物资源。在动物种类方面，在已知的33个动物门中，海洋中有32个，其中有15种是海洋所独有的。微生物方面，与陆栖微生物相比，海洋微生物处在高盐、高压、低温和低营养等极端条件下。生存环境的特异性，使海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上表现出多样性和特异性，体内存在特殊代谢途径酶，相应产生一些特殊的活性代谢物质。因此从海洋微生物中发现新酶、新化合物的概率将比陆栖微生物要大的多。海绵海绵sponge海绵（marine sponge）属于动物界多孔动物门（Porifera）,是一大类低等细胞海洋动物，约占海洋物种总量的1/15，是热带海洋中除珊瑚外的第二生物量，全世界约有1000015000种。桶状海绵桶状海绵 玻璃海绵玻璃海绵 海绵的形态变化很多，最典型的有中空壶状、花瓶装及囊状，海绵的形态变化很多，最典型的有中空壶状、花瓶装及囊状，有时也呈扁平、圆筒状、条状、叶状和圆砖状，它们的体色变有时也呈扁平、圆筒状、条状、叶状和圆砖状，它们的体色变化从黄、蓝、桃红至白、黑色均有，体高也从化从黄、蓝、桃红至白、黑色均有，体高也从1200cm不等。不等。海绵是一种原始的无脊椎动物，生活在海洋中的岩石上，只有极少数分布在淡水中,从潮间带到9000m的深海均有分布，靠近河口处的海域往往更丰富，常有其优势种.海绵是固生、多孔、滤食性动物,其体表有很多细小的管道，海水通过这些管道流经体内，海绵就以海水中的微生物和其他有机碎片作为食物来源。其过滤微生物的效率可达75%99%海绵的滤水系统非常发达，据报导，有一种海绵，每1千克的体重在一昼夜可过滤24吨的海水。在海绵滤食过程中，许多微生物尤其是不能被消化的微生物得以在海绵体内保留，这样在海绵体内和体表就富集了大量的微生物。海绵体内和体表富集了大量的微生物海绵中的微生物分布在宿主细胞的胞外和胞内，如海绵外层海绵中的微生物分布在宿主细胞的胞外和胞内，如海绵外层的胞外共生微物和海绵中胶层的胞内共生微生物。胞内（包的胞外共生微物和海绵中胶层的胞内共生微生物。胞内（包括细胞质内和细胞核内）的生物可以长久的存在于细胞和细括细胞质内和细胞核内）的生物可以长久的存在于细胞和细胞核内。胞核内。海绵微生物的分布海绵微生物的分布海绵微生物的多样性海绵微生物的多样性 海绵微生物（marine sponge microorganisms）的定义是比较广泛的，所有自海绵组织中分离得到的微生物都可以定义为海绵相关微生物（marine sponge associated microorganisms），包括偶然出现在海绵体内的微生物，海绵中胶层（mesohyl）内的微生物，永久性生存在海绵细胞内部的微生物。海绵中的微生物古细菌异养细菌蓝细菌绿藻红藻鞭毛虫硅藻真菌海绵中微生物的数量在不同的宿主中有一定的差异。海绵中微生物的数量在不同的宿主中有一定的差异。海绵相关的细菌海绵相关的细菌 海绵中细菌的分布遵循一个常规的模式：(1)有光合活性的微生物，像蓝藻，真核藻类，分布于外面光曝露的组织层。(2)异养的，可能也有一些自养的细菌分布于内层。早期研究海绵与细菌的联系 （基于细菌形态学）类似于周围海水环境的细菌，并不是海绵所特有的 细胞内的细菌，它们是海绵所特有的 细菌在海绵的胶层中，也是海绵所特有的 海绵相关的真菌海绵相关的真菌从生态学上讲真菌在营养更新的循环中起着重要的作用，一些海洋真菌会引起海洋动物和植物的疾病，而其它一些真菌会与一些器官形成互助的共生关系。一些真菌产生毒素，一些会是免疫损害海洋动物和海滩游泳者的病原菌。从六个不同的区域（包括温带，亚热带，热带）中的海绵分离的真菌中寻找新的天然化合物，从16个海绵种中一共分离得到681真菌菌种。分离的真菌属于13个子囊菌属类，2个接合菌类，37个放线菌类真菌。不同的区域的样本，真菌属的多样性和每个样本分离得到的真菌数量是不同的。(1)细菌细胞壁的特征（革兰氏阳性和革兰氏阴性）(2)用透射电子显微镜观察的细菌细胞膜的结构（1）受到培养条件的限制。因为即使在海绵中只是微量组分的微生物，在一定得培养条件下也会成为优势菌种。海绵相关微生物研究技术海绵相关微生物研究技术1.早期对海绵共附生微生物多样性的研究主要是通过形态观察早期对海绵共附生微生物多样性的研究主要是通过形态观察(显微镜显微镜)2.2.培养的方法（培养的方法（生理学和系统发育学的多样性）（2）很多微生物是没有被培养过或不可培养的据估计，在实验室条件下培养鉴定的微生物只是海洋环境中的极少部分（约占总类别的0.11%）一些有特殊生理特性的细菌已经从海绵中分离得到，诸如：需氧化能异养菌，固氮菌，甲烷氧化细菌，光合细菌，厌氧光合菌。在最近，从几种海绵中培养得到了新的放线菌。3.分子生物学技术分子生物学技术（不依赖于培养）（1）16S rDNA序列序列16S rDNA技术能很精确的确定细菌的种属位置.16S rDNA是存在于核糖体上的一段长约1500bp的基因序列。16S rDNA因进化缓慢，种属特异性强而成为生物进化中的化石。由于其能快速准确地对细菌分类进行定位而称为细菌“指纹”。16S rDNA已经成为细菌鉴定系统的一个基本指标将实验中测定的将实验中测定的16S rDNA序列输入到一些国际上著名的核酸序列数据库序列输入到一些国际上著名的核酸序列数据库进行比对分析来寻找其最为相近的种属，确定菌株的分类位置。进行比对分析来寻找其最为相近的种属，确定菌株的分类位置。DGGE的原理是在聚丙烯酰氨凝胶中加入DNA变性剂，在电场作用下形成变性剂浓度梯度，双链DNA分子在变性凝胶中发生解链，由于PCR产物的碱基组成不同，因此随变性剂浓度的增大，样品在电泳中顺从解链，而率先解链的由于迁移阻力的增大而涌动较慢，后解链的则电泳中位移较快。这样相同长度的DNA双链分子就可以得到分开。2.变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE）它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。3.荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）用不同微生物用不同微生物16S rDNA的荧光原位杂交技术（的荧光原位杂交技术（FISH），在海绵组织），在海绵组织薄片上，对海绵体内微生物进行荧光原位杂交分析，结果表明在不需薄片上，对海绵体内微生物进行荧光原位杂交分析，结果表明在不需要对微生物（其中包括许多不可分离培养的微生物）进行分离培养的要对微生物（其中包括许多不可分离培养的微生物）进行分离培养的条件下，可以将存在于海绵中质层内的细菌，精确分类到属甚至种的条件下，可以将存在于海绵中质层内的细菌，精确分类到属甚至种的水平上。水平上。海绵微生物和海绵天然产物海绵微生物和海绵天然产物两千多年前，地中海沿岸的居民就将海绵的角质骨骼用于沐浴、洗涤、医两千多年前，地中海沿岸的居民就将海绵的角质骨骼用于沐浴、洗涤、医药、美术和美容等，古时欧洲人还将其用做止血剂。我国的本草纲目也记药、美术和美容等，古时欧洲人还将其用做止血剂。我国的本草纲目也记载了一种名为紫梢花的淡水海绵可以入药。载了一种名为紫梢花的淡水海绵可以入药。就目前所知，海绵是迄今为止海洋天然产物的最大来源。就目前所知，海绵是迄今为止海洋天然产物的最大来源。天然产物研究开发的国际权威杂志“Natural Products Reports”每年度都进行海洋天然产物综述，在（20022004）各类杂志上发表的海洋天然产物中，来源于海绵的分别占到了36.3（316/869）、38.2（303/793）和32.6(247/756)。海绵天然产物主要表现为抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗疟疾、抗污染、驱虫和酶抑制剂等活性。海绵相关微生物的药物化合物海绵相关微生物的药物化合物从已公布的海绵化学成分来看，海绵生物活性化合物可分为萜类、甾醇、大从已公布的海绵化学成分来看，海绵生物活性化合物可分为萜类、甾醇、大环内酯、生物碱、肽类、高级脂肪醇（酸、酯）及含硫、含卤素化合物等，环内酯、生物碱、肽类、高级脂肪醇（酸、酯）及含硫、含卤素化合物等，其中以萜类化合物含量最多。这些化合物大多具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、其中以萜类化合物含量最多。这些化合物大多具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血压、凝血和融血等生理活性作用。降血压、凝血和融血等生理活性作用。例如：例如：1.从贪婪倔海绵从贪婪倔海绵Dysidea avara中分离得到的两种倍半萜中分离得到的两种倍半萜Avarol及其氧化产物及其氧化产物Avarone具有抑制具有抑制HIV逆转录酶且对病毒装逆转录酶且对病毒装配和释出液有阻断作用配和释出液有阻断作用2.以海绵尿苷为先导化合物研制开发的阿糖胞苷（以海绵尿苷为先导化合物研制开发的阿糖胞苷（Ara-C），临），临床上主要治疗急性白血病和消化道癌症床上主要治疗急性白血病和消化道癌症海绵相关微生物产生的酶海绵相关微生物产生的酶淀粉酶，纤维素酶，蛋白酶，和其它水解酶在工业上用于药物，食品，饮料，糖果，也在纺织和皮革生产，废水的处理中有广泛的应用 海绵悬浮于包含大量有机颗粒的海水中。因此，有理由相信海绵中的一些微生物或者海绵自身会产生一些水解酶类来使一些有机物质转换为营养物质。从海绵Spirastrella sp.中分离到得细菌Arthrobacterilicis和真Mucor sp.被发现能够产生乙酰胆碱酯酶和淀粉酶，这两种酶是热耐性型的，它们的活性不受海水中相对高浓度的主要阳离子Na+,Ca2+,and Mg2+,的影响。海绵中分离得到的细菌和其相关产物海绵中分离得到的细菌和其相关产物海绵中分离得到的放线菌和其相关产物海绵中分离得到的放线菌和其相关产物海绵中分离得到的真菌和其相关产物海绵中分离得到的真菌和其相关产物海绵中分离得到的蓝细菌和其相关产物海绵中分离得到的蓝细菌和其相关产物海绵能生产丰富的天然产物是与栖息其中的微生物资源分不开的，海绵能生产丰富的天然产物是与栖息其中的微生物资源分不开的，海绵和海绵微生物一起已经形成了一个小的生态系统，共同促进海海绵和海绵微生物一起已经形成了一个小的生态系统，共同促进海绵的生长并抵御外来捕食者等。绵的生长并抵御外来捕食者等。研究海绵微生物的多样性和生物技术潜能需要微生物学家，天然产物化学家，真菌学家，生物工程学家的协调合作。