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Gene detection,cloning and transformation目的基因可克隆的优良性状的相关基因主要是结构基因DNA克隆DNA cloningSubcloningHost and vectorDNA librariesScreening librariesAnalysis of clonesApplication of clone结构基因组成转录启动子、基因编码区、转录终止子。启动子：DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。转录起始位点：转录mRNA的第一个碱基，多数是A，以此作为序列的1，其上游核苷酸序列为“一”，下游核苷酸序列为“”。基因编码区：包括起译码ATG、开读框和休止码TAA（TAG、TGA）。终止子：提供转录停止信息的核苷酸序列。原核生物结构基因组成多数以操纵子形式存在，同类功能的多个基因聚在一起，处于同一个启动子调控之下，下游同具一个终止子，但各基因分别有起译码ATG和休止码TAA（TAG、TGA）。两个基因之间存在长度不等的间隔序列，但有例外。启动子含3535序列保守区5TTGACA3，1010序列保守区5 TATAAT3。操纵子除启动子外，往往有一些调控转录的其他因子。在起译码上游约1010bpbp处，有一SD保守区，一般为AGGA。转录终止之前常有一段回文序列结构终止子。真核生物结构基因组成基因单独存在，两个基因之间有很长的间隔序列区。内含子、外显子。内含子、外显子。转录启动子有3个保守序列区：2020-3030：TATA框，DNA在此处开始解链；7070：CAAT框，RNA聚合酶结合。更上游：GC框，转录调控因子结合。休止码下游有一保守的AATAAA提供转录产物的释放信号。不具SD序列区，核糖体与转录的mRNA结合靠mRNA5端添加的“帽”结构。分离目的基因通过构建cDNA文库和基因组文库 产生的cDNA只含编码序列，进行表达还须外加启动子、终止子等调控转录元件。由于mRNA在不同组织、不同发育时期的细胞内丰度不同，必须用高丰度的mRNA来构建cDNA文库。用PCR 技术Gene cloningGene cloning DNA DNA flagmentsflagments a.a.chromosalchromosal DNA from animal,plants and microbes DNA from animal,plants and microbes；b.b.cDNAcDNA from from mRNA mRNA reverse reverse transcripted transcripted in vitroin vitroc.chemical c.chemical synthersizedsynthersized DNA DNA insert insert foreigh foreigh DNA into DNA into plasmidplasmid transformationtransformation selection and identificationselection and identification expression analysisexpression analysis 原核生物的人工转化原核生物的人工转化 对于体外连接的重组DNA分子，必须采取特殊的保护措施，否则在几小时内就会全部降解。因此在连接后，应尽快引入受体细胞。许多细菌不具有自然转化的能力，需要通过人工诱导才能出现感受态。competencecompetence 自然界中不是所有细菌都能进行自然转化，也不是生长的任何阶段都具有吸收DNA的能力，把细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态。感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合。这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的；DNA的进入和整合均为单链状态。转化效率决定于三个内在因素:受体细胞的感受态；受体细胞的限制酶系统，它决定转化因子在整合前是否被分解；受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合，因为转化因子总是与碱基顺序相同的或相近的受体DNA相配合，亲缘关系越近的其同源性也越强。当 DNA与细胞在 Ca2+和DMSO存在条件下混合，在水浴中反应2040分钟以后进行45的热脉冲(heat shock)可增加DNA的吸收。大肠杆菌摄取DNA是非选择性的，而且可以用异源启动子启动转录和蛋白质合成，这使得大肠杆菌成为克隆实验的理想系统。CaCl2方法的转化效率一般可达106-107转化子/g DNA。关键是(1)使用对数生长期的细菌；(2)低温操作。优点:简单、稳定、可重复性高。缺点:转化效率稍低，而且不能转化大质粒(15Kb)影响细菌转化频率影响细菌转化频率:转化DNA的浓度、纯度和构型转化细胞的生理状态经CaCl2处理后的成活率转化环境：温度、pH、离子浓度MgCl2转化：Mg+对于维持DNA稳定性方面，可能起到重要的作用。克隆子的筛选 利用抗菌素抗性基因等标记 抗性基因、X-gal和IPTG蓝白斑双酶切片段重组法报告基因（GUS、LUC、NPT-II、CAT）克隆子的鉴定酶切分子 杂交：斑点、Southern杂交PCRDNA测序转录产物检测翻译产物检测PEG(PEG(polyethylemepolyethyleme glycol 6000)glycol 6000)适用：不能形成感受态的G+细菌 用细胞壁降解酶完全除去肽葡聚糖层，使其维持在等渗培养基中，在PEG存在条件下，质粒或噬菌体DNA可高效地被导入原生质体。植物细胞转化TiTi转化法转化法 叶盘转化法、原生质体共培养法、悬浮细胞共培养法直接转移法直接转移法 电穿孔、微弹轰击法、激光微束穿孔法、多聚物介导法、花粉管通道法、显微注射法、脂质体介导法。建立对植物有效转化基本要求：建立对植物有效转化基本要求：(1)转化系统不受基因型的限制；(2)易于获得大量的转基因植株；(3)尽可能缩短获得转基因植株的周期；(4)避免使用原生质体作为转基因受体。基因枪转化方法基本满足了上述要求。biolisticbiolistic transformation transformationParticle bombardmentBiolistic processHigh-velocity micro projectile原理：原理：籍高速运动的金属微粒将附着于其表面的包裹有DNA的钨象子弹一样以高压射进细胞并使DNA留在细胞内，特别是留在细胞器中。types of types of biolistic biolistic and and tansformation tansformation mechanismmechanism基因枪法：基因枪法：利用火药爆炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速金属粒子(微弹)，使其进入带壁细胞的一种方法。质粒DNA首先沉淀在微弹(钨粉、金粉等)表面(通常以氯化钙、亚精胺作为沉淀剂来促进DNA与微弹的结合)，结合有DNA分子的微弹经加速而获得足够动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，随后释放出DNA分子并随机整合到寄主的基因组内。根据动力来源的不同，基因枪大体可以分为火药式、放电式和气动式三种类型。Electric dischargeElectric discharge 工作原理：通过高压放电引起水滴气产生冲力，驱 动微弹载体连同微弹加速运动。“气动式 ”和“放电式”都具有精确调节微弹速度 的性能转化受体要求：凡具备再生能力的细胞或组织十分广泛：原生质体、悬浮细胞、根茎切段、叶圆 片、成熟胚、幼胚、分生组织、愈伤组 织、花粉细胞和胚芽鞘等选择适当的转化受体材料：十分关键。最常用有细 胞悬浮系、愈伤组织、幼胚、成熟胚和茎尖分 生组织。影响基因枪转化频率的因素影响基因枪转化频率的因素理化因素：基因枪的一些轰击参数，包括微弹的速 度、挡板与靶细胞间的距离(射程)、弹 膛内的真空度、轰击次数、DNA的纯度 与浓度、微弹的类型、大小及用量以 及DNA沉淀剂(氯化钙与亚精胺)的浓度 等。生理因素：轰击前后的培养条件 不同生理状态的植物材料接受外源DNA 的能力是不同的动物细胞转化病毒颗粒转导法磷酸钙转染法DEAE-葡聚糖转染法DMSO（二甲基亚砜）转染法脂质体介导法显微注射基因打靶电穿孔transformation for mamalial animalsa.磷酸钙沉淀法:Ca2+促进 哺乳动物细胞吸收b.外源DNAb.共转化：将过量的媒介DNA与带有tk基因的 重组DNA 混合，用Ca2+沉淀转化细胞。c.微量注射：一台仪器每小时注射500-1000个细胞，约50%的细胞能稳定地整合并表达，任何DNA都可注射到任何细胞中，效率高，不需筛选压力，但需要昂贵的仪器，技术复杂，难以掌握。electroporationelectroporation许多细菌和真核系统，无感受态操作方便、基因转移效率高，适用真核生物和原核生物方法：用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞。大肠杆菌中，优化参数（电场强度、电脉冲长度、DNA的浓度），每微克DNA可得到109-1010转化体主要影响因素主要影响因素:脉冲最大电压：电压太小，转化效率低；电压太大，细胞不能成活。脉冲持续时间线性化DNA有较高的重组机率；一般电击前后将细胞置冰浴10min调节电场强度和脉冲长度使50-75细菌死亡，可得到最高转化效率。最高转化率可达109-1010转化子/g DNA。转化率转化率 每毫克转化的质粒DNA所产生的具抗生素抗性的克隆数转化子的增殖与保存 单克隆，接种含选择标记抗生素的液体培养基中，部分菌液冻存于甘油保存液中。克隆技术的应用重组蛋白GMODNA指纹分析医学诊断基因治疗