7 高等动物基因工程.pptx

7 高等动物基因工程世界上第一只成年体细胞克隆羊世界上第一只成年体细胞克隆羊“多利多利”多利的基因母亲 普通白绵羊 乳腺细胞 细胞核 剔除了细胞核的苏格兰黑脸羊的卵子科学家当时一共培育了277个胚胎，最后只有多利成功出生。体细胞克隆技术的低成功率，一直到现在也没有明显改善。克隆动物是否会早衰，是否可能有先天缺陷，是否应当允许科学家进行以培育完成人类个体为目标的克隆人研究，都是当前争论的热点问题。多利的健康状况因此受备关注。多利简介多利简介移植到第三头羊融合、分裂、发育成胚胎全球首只人羊嵌合体。英国媒体24日报道说，科研人员已经创造出全球首只人羊嵌合体，有望给需要器官移植的患者带来福音。英国每日邮报报道说，美国内华达大学教授伊斯梅尔。赞贾尼历经7年研究，最终利用向绵羊胚胎注射人体干细胞的技术，成功培育出一只含有15人体细胞的绵羊。赞贾尼表示，这项技术的最终目的，就是要在绵羊身上培育出可向人体移植的器官。此前，赞贾尼已经成功培育出一个人体细胞占较大比例的羊肝。但有人担心，如果人体细胞和动物细胞最终结合到一起，就可能产生人羊“混血儿”，引发社会伦理危机。重庆晨报 动物转基因技术的基本概念动物转基因技术利用转基因的重组子构建技术重组子构建技术，重组分子导入动物体内的转转化技术化技术，转基因在受体细胞染色体上的稳定整合及可控制性稳定整合及可控制性表达技术统称为表达技术统称为转基因技术转基因动物转基因动物 指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。传给后代的一类动物。1981年，第一次成功地将外源基因导年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。入动物胚胎，创立了转基因动物技术。根据不同的目的，转基因动物操作可以简单地划分为四种类型：（l）疾病型转基因动物；（2）利用转基因动物制药；（3）动物改良型；（4）基础生物学研究。v2 2、动物转基因技术程序、动物转基因技术程序将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。v3 3、动物转基因的效率、动物转基因的效率 动物基因转移的起点和终点分别为动物基因转移的起点和终点分别为受精受精卵卵和含有整和含有整合转基因的合转基因的动物子代动物子代。在这个过程中，转基因的效。在这个过程中，转基因的效率极低。率极低。以小鼠转基因为例：以小鼠转基因为例：注射外源基因后注射外源基因后受精受精卵的存活率为卵的存活率为8686；将将受精受精卵卵移殖到母鼠子宫内后受精移殖到母鼠子宫内后受精卵的存活率为卵的存活率为2525,母鼠的怀孕母鼠的怀孕率为率为8080,转基因在基因组上的整合率为转基因在基因组上的整合率为2424,因此小鼠转基因的总有效率约为因此小鼠转基因的总有效率约为4 4.影响因素转基因性质转基因的程序外源基因的大小动物转基因的结构基因组片段：分子量大，保持完整的基因结构小基因：同一基因的某一或若干区域融合基因：结构基因，非编码序列以及表达调控序列的来源不同靶基因：结构基因或调控序列经过诱变或定向突变处理，然后重新输入回动物体内插入基因：在动物染色体上随机或特异性插入的位点，根据需要也可以加装标记基因置换基因；两侧含有其他的同源序列，用于动物基因的定位分离与克隆动物转基因的表达特性转基因的时空特异性表达相关基因的时序特异性和组织特异性转基因的可控性表达根据受体细胞的性质和启动子类型来摸索诱导被转基因的表达控制条件转基因的共抑制效应共抑制效应：当受体细胞染色体上含有转基因的同源伙伴时，转基因与内源性同源基因的表达将同时受到抑制共抑制效应的特征共抑制只发生在转基因与同源的内源性基因之间，对其他基因的表达不产生影响如果转基因与内源性发生体内重组，则共抑制效应随之消失，基因表达恢复正常共抑制现象的发生与结构基因编码区有关，但不依赖于启动子的来源和性质两个相同的转基因之间也能发生共抑制效应转基因导入动物体内的方法v 胸苷激酶基因的选择系统胸苷激酶基因的选择系统v 胸苷激酶胸苷激酶(thymidine kinase,TK)是核苷酸合成代谢途径中的一种酶是核苷酸合成代谢途径中的一种酶,能够能够将胸苷转换为胸苷一磷酸将胸苷转换为胸苷一磷酸.在单纯疱疹病毒在单纯疱疹病毒(HSV)中发现的中发现的tk基因基因,几乎在所有几乎在所有的真核细胞中都能有效地表达的真核细胞中都能有效地表达,所以选择为遗传标记基因所以选择为遗传标记基因.v 该系统中该系统中,首先要首先要建立建立TK-表型的细胞株表型的细胞株.v 采用采用诱变加选择诱变加选择的方法的方法:在细胞培养时加胸苷类似物在细胞培养时加胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷溴尿嘧啶脱氧核苷BUdR,TK催化其掺入细胞的催化其掺入细胞的DNA分子中分子中,导致导致DNA复制出现错误复制出现错误.具有具有BUdR-DNA的细胞对的细胞对UV特别敏感特别敏感,迅速被杀死迅速被杀死,而少数而少数TK-表型的细胞株存活表型的细胞株存活.目前最常用的是小鼠目前最常用的是小鼠L细胞的细胞的TK-突变株突变株(优点优点:产生回复突变的频率低产生回复突变的频率低,而且而且容易被外源容易被外源DNA所转化所转化).v HAT选择法选择法v1962年年E.H.Szybalska 和和 W.Szybalski 设计的设计的,由于选择由于选择TK+细胞的培养基中含有次黄嘌呤细胞的培养基中含有次黄嘌呤(hypoxanthine),氨基蝶氨基蝶呤呤(aminopterin,APT),胸苷胸苷(thymidine),所以叫所以叫HAT选择选择法法.v基本原理基本原理:v加氨基蝶呤加氨基蝶呤APT,APT,二氢叶酸还原酶被抑制二氢叶酸还原酶被抑制,从而阻断从而阻断dTTP,dATP,dGTPdTTP,dATP,dGTP的重新合成途径的重新合成途径;v加次黄嘌呤加次黄嘌呤,启动启动dATP,dGTPdATP,dGTP的补救合成途径的补救合成途径;v加胸苷加胸苷,TK+,TK+细胞能通过胸苷激酶的作用合成细胞能通过胸苷激酶的作用合成dTTP,dTTP,细胞继续存活细胞继续存活;TK-;TK-细胞则死亡细胞则死亡.v所以所以,使用使用HATHAT培养基能够选择出由培养基能够选择出由tktk基因转化而来基因转化而来的的TK+TK+细胞细胞.vC 高等哺乳动物的载体系统v8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达v人腺病毒DNAv猴空泡病毒DNA（SV4400）v人乳多瘤病毒DNA（BKV）v人牛痘病毒DNA动物病毒的特点动物病毒的特点v1、有能够被真核细胞识别的有效的启动子；v2、在感染周期中能够持续地复制使基因 达到相当高浓度,并实现有效的表达；v3、病毒能具有效控制自己复制的顺式元件和反式作用因子，改造后可发展成为能够在细胞内长时间的保持高拷贝的外源基因的复制型质粒载体；动物病毒的特点动物病毒的特点v4、能高效稳定地整合到染色体,可提高外源基因导入寄主细胞染色体的效率；v5、病毒外壳蛋白能够识别细胞接受器，能够将外源蛋白高效地导入宿主细胞(假病毒粒子法)。二二 反转录病毒载体类型反转录病毒载体类型1.简介简介:Retroviruses,是一类含有单链RNA的动物病毒.基因组含有2条相同的正链RNA分子,包装成二倍体病毒颗粒.此外,颗粒内还含有tRNA引物分子,反转录酶,RNaseH,整合酶等.2.分分3个类群个类群:泡沫病毒(foamy viruses)类群,慢病毒(entiviruses)类群(如HIV-I,II型),致癌病毒onco viruses类群.3.反转录病毒的优点反转录病毒的优点 (1)大多数情况下,反转录病毒的肿瘤基因都能在正常细胞中转录,利用之作为天然转导因子,改建成载体.(2)寄主范围广,包括无脊椎和脊椎动物;(3)具有强启动子,有效表达外源基因;(4)不但感染率高,而且不会导致宿主细胞死亡,且形成感染性病毒颗粒.反转录病毒的一般生物学特性反转录病毒的一般生物学特性1 生命周期生命周期第一时相从病毒颗粒脱壳到整合到寄主基因染色体上,成为原病毒(provirus);第二时相原病毒开始转录,合成并加工成mRNA,进而转译蛋白,组装颗粒,释放病毒.反转录病毒的一般生物学特性反转录病毒的一般生物学特性v2 基因组特点基因组特点v 有4条RNA链,r序列,U3(转录加尾信号)和U5(转录起始信号)序列.v3 编码读框编码读框v 核心部分有3个开放读框,两侧是控制表达的信号区.5.5.反转录病毒载体类型反转录病毒载体类型v1、辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体；、辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体；v2、无需辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒、无需辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒v 载体；载体；v3、广寄主范围的反转录病毒载体；、广寄主范围的反转录病毒载体；v4、反转录病毒表达载体、反转录病毒表达载体.1、辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体、辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体构建:从原病毒DNA上移去gag,pol,env等3个基因的全部或大部分序列,保留下5-LTR,3-LTR以及pBS+ve,PBS+ve和包装位点psi.然后加入选择标记基因构成重组载体.标记基因的ATG要恰好插在gag基因的原来位置.2 2、无需辅助病毒互补的重组的反转录病毒、无需辅助病毒互补的重组的反转录病毒质粒载体质粒载体利用包装细胞株,在它的染色体基因组DNA的某个位点整合有缺失了psi序列的原病DNA.因此可以合成全部蛋白质,但不能包装自己的基因组,而包装反转录病毒载体.利用动物转基因研究基因的表达与功能目的：基因导入动物受体细胞后在体内的表达调控特征以及相应的生物学效应研究发育过程中相关基因的表达顺序，调控开关以及表达的时空特异性利用转报告基因探测动物基因组的调控序列作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。转基因动物v报告基因报告基因(reporter gene)v一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，v一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。v常用的报告基因v氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。vcat基因，检测可通过放射自显影观察。v荧光酶基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高301000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点。分析教材341342图77转报告基因及生物学效应分析利用同源基因灭活细胞内源基因同源重组重组(recombination)的本质 基因的重排或交换.即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间,通过断裂和重接,交换DNA片段从而改变基因的组合和序列.同源重组(Homologous recombination)指DNA同源序列间的重组,常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间。可通过同源重组将外源基因定位整合到细胞基因组中.利用同源基因灭活细胞内源基因利用同源基因灭活细胞内源基因一方面可序列特异性灭活细胞内源基因，直接构建功能丧失型缺陷株，阐明内源基因的生物学效应另一方面可将外源基因置换细胞内源基因或染色体区域，形成功能获得型突变体，用于改良动物物种和人体基因治疗利用反义基因抑制细胞基因表达目的阻断其mRNA的翻译而不是破坏基因本身途径一从细胞中分离靶基因的mRNA，并以此为模板由细菌动物细胞高效表达异源蛋白的基本原理利用动物乳腺组织生产蛋白药物乳腺作为生物反应器的优点乳汁是可连续合成并分泌的机体液体频繁采集不会对转基因动物构成危害转基因产物只局限在乳腺细胞中表达，不会干扰动物整个机体的正常生理状态在动物体内表达后对人体不容易产生免疫反应动物乳汁中蛋白组分不多，且性质和含量已知，大规模分离纯化十分方便转基因技术在动物遗传性状改良中的应用基因治疗基因治疗 第一次白色革命是建立公共健康设施及卫生制度；第一次白色革命是建立公共健康设施及卫生制度；第二次白色革命是将麻醉技术用于外科手术；第二次白色革命是将麻醉技术用于外科手术；第三次白色革命是疫苗和抗生素的出现与使用；第三次白色革命是疫苗和抗生素的出现与使用；第四次白色革命是分子水平上的基因疗法它可以治第四次白色革命是分子水平上的基因疗法它可以治疗许多不治之症。疗许多不治之症。基因治疗的历史基因治疗的历史 1990 1990年年9 9月月1414日日,美国政府首次批准了一项基因治疗美国政府首次批准了一项基因治疗临床研究计划：临床研究计划：对一台患有腺苷脱氨酶（对一台患有腺苷脱氨酶（ADAADA）缺陷的重度联合免疫缺陷症）缺陷的重度联合免疫缺陷症（SCIDSCID）4 4岁女童进行基因治疗并获得成功。该患者今年已岁女童进行基因治疗并获得成功。该患者今年已经经1010岁了。从而开创了医学界的新纪元。岁了。从而开创了医学界的新纪元。在在19801980年，年，clinecline等人就对两名重度地中海贫血症患等人就对两名重度地中海贫血症患者进行了基因治疗，未获成功。者进行了基因治疗，未获成功。基因治疗的概念基因治疗的概念v在某一个体的细胞中导入新基因，利用该基因的表达产物治疗疾病在某一个体的细胞中导入新基因，利用该基因的表达产物治疗疾病.用正常基因取代病人细胞中的缺陷基因，达到战胜分子病的目的 在基因治疗中，目的基因被导入到靶细胞，它们或者与宿主细胞染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与宿主染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞内表达v基因治疗的对象：基因病或分子病患者基因治疗的对象：基因病或分子病患者v根据病变基因所处的细胞类型可分为：根据病变基因所处的细胞类型可分为：v遗传性分子病，病变基因位于生殖细胞中，可遗传后代。如血友病。遗传性分子病，病变基因位于生殖细胞中，可遗传后代。如血友病。v非遗传性分子病，病变基因位于体细胞中。如癌症，病毒感染症。非遗传性分子病，病变基因位于体细胞中。如癌症，病毒感染症。v根据病变基因的数目，可分为：根据病变基因的数目，可分为：v单基因病，如家族性高胆固醇血症、囊状纤维变性症、神经肌肉症单基因病，如家族性高胆固醇血症、囊状纤维变性症、神经肌肉症v多基因病，如癌症、艾滋病、糖尿病、心血管疾病、神经变性病。多基因病，如癌症、艾滋病、糖尿病、心血管疾病、神经变性病。v基因治疗的内容基因治疗的内容v基因诊断、基因分离、载体构建、基因转移四项基基因诊断、基因分离、载体构建、基因转移四项基本内容。本内容。v基因诊断：基因发生缺陷的主要原因如基因突变、基因诊断：基因发生缺陷的主要原因如基因突变、基因缺失、基因插入、基因重排等；缺陷基因的定基因缺失、基因插入、基因重排等；缺陷基因的定位方法很多。位方法很多。如：限制性片段长度多态性分析（如：限制性片段长度多态性分析（RPLE）；）；PCR扩增靶序列及序列分析（扩增靶序列及序列分析（PCR）；）；单链构型多态性分析（单链构型多态性分析（PCR-SSCP）；）；HGP序列库搜寻。序列库搜寻。v基因分离：用于治疗的基因的克隆、重组、鉴定、扩增、纯化。基因分离：用于治疗的基因的克隆、重组、鉴定、扩增、纯化。v基因载体构建：用于治疗的基因可通过载体导入体内，也可以将基因直接注入体基因载体构建：用于治疗的基因可通过载体导入体内，也可以将基因直接注入体内。载体可分为病毒类或非病毒类二种，病毒类载体一般都需要重新构建，去除内。载体可分为病毒类或非病毒类二种，病毒类载体一般都需要重新构建，去除其复制区和感染区，并将治疗基因插入其中。其复制区和感染区，并将治疗基因插入其中。v基因转移：将基因通过载体或直接导入病变细胞中，这存在着两种方式：基因转移：将基因通过载体或直接导入病变细胞中，这存在着两种方式：生殖细胞或胚胎细胞：这种治疗方法面临伦理学和法学方面的问题，目前无人敢去碰生殖细胞或胚胎细胞：这种治疗方法面临伦理学和法学方面的问题，目前无人敢去碰它。它。体细胞：它又有两种方法：体细胞：它又有两种方法：体内疗法：将基因直接导入病变细胞内；体内疗法：将基因直接导入病变细胞内；体外疗法：将病变细胞取出体外，在体外将基因导入，并经体外增殖，再将细胞输回体外疗法：将病变细胞取出体外，在体外将基因导入，并经体外增殖，再将细胞输回体内。体内。v基因转移的基本方式基因转移的基本方式v分别适用于基因治疗的体外疗法和体内疗法：分别适用于基因治疗的体外疗法和体内疗法：v用于体内疗法的基因转移方式用于体内疗法的基因转移方式重组病毒颗粒的直接注射、组织、器官、血液重组病毒颗粒的直接注射、组织、器官、血液 重组重组DNA分子直接注射横纹肌，如骨骼肌、心肌。分子直接注射横纹肌，如骨骼肌、心肌。呼吸通气溶胶：重组基因包裹在脂质体中，做成气溶胶，通过呼吸作用进入呼吸通气溶胶：重组基因包裹在脂质体中，做成气溶胶，通过呼吸作用进入机体呼吸道的上皮细胞。机体呼吸道的上皮细胞。粒子轰击基因转移技术基因枪：将治疗基因或涂抹在金颗粒表面或包在金粒子轰击基因转移技术基因枪：将治疗基因或涂抹在金颗粒表面或包在金颗粒内。然后采用高压电极产生的动力将金颗粒打入器官、组织或细胞内。颗粒内。然后采用高压电极产生的动力将金颗粒打入器官、组织或细胞内。电穿孔技术：将质粒电穿孔技术：将质粒DNA皮下注射，使之暴露于真皮上，然后在表皮和真皮皮下注射，使之暴露于真皮上，然后在表皮和真皮之间加之间加400600v/cm的电场，适用于皮肤组织。的电场，适用于皮肤组织。v基因转移：将基因通过载体或直接导入病变细胞中，这存在基因转移：将基因通过载体或直接导入病变细胞中，这存在着两种方式：着两种方式：v生殖细胞或胚胎细胞：这种治疗方法面临伦理学和法学方面生殖细胞或胚胎细胞：这种治疗方法面临伦理学和法学方面的问题，目前无人敢去碰它。的问题，目前无人敢去碰它。v体细胞：它又有两种方法：体细胞：它又有两种方法：体内疗法：将基因直接导入病变细胞内；体内疗法：将基因直接导入病变细胞内；体外疗法：将病变细胞取出体外，在体外将基因导入，并经体外疗法：将病变细胞取出体外，在体外将基因导入，并经体外增殖，再将细胞输回体内体外增殖，再将细胞输回体内v肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗v增强肿瘤免疫原性、提供细胞因子、抑制癌基因的增强肿瘤免疫原性、提供细胞因子、抑制癌基因的表达、促进抑癌基因的表达、改变肿瘤和正常细胞表达、促进抑癌基因的表达、改变肿瘤和正常细胞的药物敏感性。的药物敏感性。基因治疗的基本内容基因缺陷的原因进化障碍基因点突变，缺失，插入和重排基因诊断，基因分离，载体构建和基因转移演讲完毕，谢谢观看！