【生物】重组DNA技术的基本工具课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

第三章第三章 基因工程基因工程第第1 1节节重组重组DNADNA技术的基本工具技术的基本工具 119611961年年尼伦伯格和尼伦伯格和马太马太破译了第一个破译了第一个编码氨基酸的编码氨基酸的密码密码子子。截至。截至19661966年，年，6464个密码子均被破个密码子均被破译成功。译成功。19701970年年科学家在细科学家在细菌中发现了第一个菌中发现了第一个限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（简称（简称限制酶限制酶）19531953年年沃森和沃森和克里克建立了克里克建立了DNADNA双螺旋结双螺旋结构模型并提出构模型并提出了遗传物质了遗传物质自自我复制我复制的假说。的假说。19671967年年，科学家，科学家发现，在细菌拟发现，在细菌拟核核DNADNA之外的之外的质质粒有自我复制能粒有自我复制能力力，并，并可以在细可以在细菌细胞间转移菌细胞间转移。2020世纪世纪7070年代初，年代初，多多种种限制酶限制酶、DNADNA连接连接酶酶和和逆转录酶逆转录酶被相继被相继发现。这些发现为发现。这些发现为DNADNA的的切割、连接切割、连接以以及功能基因的获得创及功能基因的获得创造了条件。造了条件。基因工程发展历程基因工程发展历程19195050年年埃特曼发埃特曼发明了一种测定氨明了一种测定氨基酸序列的方法。基酸序列的方法。2 2年后，桑格首次年后，桑格首次完成了对胰岛素完成了对胰岛素氨基酸序列的测氨基酸序列的测定。定。19195858年年梅塞尔森和梅塞尔森和斯塔尔用实验斯塔尔用实验证明证明了了DNADNA的半保留复的半保留复制制。随后不久，克。随后不久，克里克提出里克提出中心法则中心法则。219441944年年艾弗里等人通过肺艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不炎链球菌的转化实验，不仅证明仅证明了了遗传物质是遗传物质是DNADNA，还证明了还证明了DNADNA可以在同种生可以在同种生物的不同个体之间转移。物的不同个体之间转移。思考如何获得发光小鼠动物细胞融合技术基因工程3图解“基因工程实质”转移萤火虫萤火虫普通动植物普通动植物发光基因发光基因A A生物生物基因基因B B生物生物4基因工程的概念 指指按按照照人人们们的的愿愿望望，通通过过转转基基因因等等技技术术，赋赋予予生生物物新新的的遗遗传传特特性性，创创造造出出更更符符合合人人们们需需要要的的新新的的生生物物类类型型和和生生物物产产品品。从从技技术术操操作作层层面面看看，由由于于基基因因工工程程是是在在DNADNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计和和施施工工的的，因此又叫做因此又叫做重组重组DNADNA技术技术。基因基因工程工程对象对象原理原理优点优点基本过基本过程程基因剪切拼接导入表达基因重组克服远缘杂交不亲和障碍、定向改造生物性状5思考基因工程如何操作？需要什么工具？8苏云金杆菌中的苏云金杆菌中的BtBt基因基因基本原理基本原理普通棉花细胞普通棉花细胞含含BtBt基因的棉花细胞基因的棉花细胞能产生能产生BtBt抗虫蛋白抗虫蛋白的棉花植株的棉花植株转入转入植物组织植物组织培养技术培养技术形成形成转基因抗虫棉目的基因的表达产物目的基因普通棉花转基因抗虫棉受体细胞Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效9“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”重组DNA技术的基本工具剪剪接接运运1010需要什么工具需要什么工具？磷酸二酯键磷酸二酯键1.来源：2.功能：3.作用的化学键：一、一、“分子手术刀”限制性内切核酸酶（简称限制酶）主要从中分离纯化出来，目前分离出数千种。识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开磷酸二酯键(3号碳上的酯键）原核生物注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。（酶的专一性）EcoR33端端33端端55端端55端端 能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列。2.2.限制酶的识别序列特点：限制酶的识别序列特点：为什么为什么限制酶可以识别剪切核酸？特点1：都可以找到一条中（心）轴线；特点2：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的正向读与另一条链反向读的碱基顺序完全一致，5，3，1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）AGAATTCBGGGGCCCCCTTAAGCCCCGGGGCCTGCAGDCTAAATCGACGTCGATTTAGD14EcoRI(在G与A之间切割)SmaI(在G与C之间切割)5555333355335533黏黏性性末末端端平平末末端端一、限制性内切核酸酶（限制酶）一、限制性内切核酸酶（限制酶）回文序列回文序列一般为一般为4 4 8 8个个或其他数量的核苷酸，最常见的为或其他数量的核苷酸，最常见的为6 6个核苷酸个核苷酸。最终产生两种切口的核酸片段最终产生两种切口的核酸片段152个相同（互补）黏性末端识别序列：GAATTC切割位点：GA之间的磷酸二酯键形成黏性末端（从5往3读）：AATTEcoR限制酶：若一个限制酶切割一次可断开个磷酸二酯键形成个相同（互补）的黏性末端消耗分子水形成_个游离的磷酸基团2222黏性末端特点产生_个切口1若一个限制酶切割一次可断开个磷酸二酯键形成个相同平末端消耗分子水形成_个游离的磷酸基团2222平末端特点产生_个切口1写出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC总结总结 不同的限制酶可能切不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端割形成相同的黏性末端同尾酶同尾酶 识别识别DNADNA分子中不同核分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶末端的限制酶20限制性核酸内切酶的命名 限制酶是如何命名的呢？是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。从大肠杆菌（从大肠杆菌（Escherichia coliEscherichia coli）的）的R R型型菌株分离来的，就用字母菌株分离来的，就用字母EcoREcoR表示；如果表示；如果它是从大肠杆菌它是从大肠杆菌R R型菌株中分离出来的第一型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成种限制酶，则进一步表示成EcoR IEcoR I 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌(Haemophilus(Haemophilus influenzae)dinfluenzae)d株中先后分离到株中先后分离到3 3种限制酶，种限制酶，则分别命名为则分别命名为:211、你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNADNA入侵时，它会入侵时，它会利用限制酶来利用限制酶来切割外源切割外源DNADNA，使之失效，以保证自身安全，使之失效，以保证自身安全。旁栏思考题222 2、试推测限制酶为什么不会切割自身的、试推测限制酶为什么不会切割自身的DNADNA？原核生物中不存在该酶的识别序列，原核生物中不存在该酶的识别序列，或识别序列已被修饰使限制酶不与之结合或识别序列已被修饰使限制酶不与之结合用同种限制酶切割(EcoEcoR)R)T G A A T T C GA C T T A A G CA G A A T T C TT C T T A A G A问问题题:把把两两种种来来源源不不同同的的DNADNA进进行行重重组组，应应该该怎怎样样处处理理？缺口怎么办缺口怎么办23将双链将双链DNA片段片段“缝合缝合”起来，起来，恢复恢复被限制酶切开的两个核苷酸之被限制酶切开的两个核苷酸之间的间的磷酸二酯键磷酸二酯键。G C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G24二、二、DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”二、二、DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”类型型E.coli DNA连接接酶T4 DNA连接接酶来源来源功能功能只只缝合合_ 缝合合_和和_结果果恢复被限制恢复被限制酶切开的两个核苷酸之切开的两个核苷酸之间的的_大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端平末端平末端磷酸二酯键磷酸二酯键3 3、种类和作用种类和作用：25（效率较低）DNA聚合酶也可以形成磷酸二酯键，能否用DNA聚合酶？A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶作用方式26项目项目DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶相同相同作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象作用结果作用结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要DNADNA的一条链作模板的一条链作模板形成完整的重组形成完整的重组DNADNA分子分子形成形成DNADNA的一条链的一条链基因工程基因工程DNADNA复制复制在在两个两个DNADNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键只能将单个核苷酸连接到只能将单个核苷酸连接到已有的已有的DNADNA片段上，形成片段上，形成磷酸二酯键磷酸二酯键DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶的比较聚合酶的比较27与与DNADNA相关的五种酶的比较相关的五种酶的比较酶酶1 1酶酶2 2酶酶4 4酶酶3 3酶酶5 5酶酶1:1:限制酶限制酶 酶酶2:DNA2:DNA连接酶连接酶 酶酶3:3:解旋酶解旋酶 酶酶4:DNA4:DNA聚合酶聚合酶 酶酶5:DNA5:DNA水解酶水解酶28二、二、DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具就是载体，被称为分子运输车。三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车”三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体-“分子运输车分子运输车”1.1.常用载体常用载体-质粒：质粒：质粒定义：质粒定义：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链环状双链DNADNA分子分子。质粒的本粒的本质质粒作为载体的优势：质粒作为载体的优势：具有一个至多个限制具有一个至多个限制酶切割位点酶切割位点进行进行自我复制自我复制便于重组便于重组DNADNA分子分子的鉴定和筛选的鉴定和筛选标记基因标记基因真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。2.2.载体需要具备的条件：载体需要具备的条件：基因可基因可插入其中插入其中：具有一个至多个具有一个至多个限制酶切割位点限制酶切割位点；复制复制的能力：的能力：能在受体细胞中复制并稳定保存能在受体细胞中复制并稳定保存；带有特殊的带有特殊的标记基因标记基因：便于：便于筛选和鉴定；筛选和鉴定；对受体细胞对受体细胞无害（无害（安全性安全性）；易分离获得。）；易分离获得。3.3.其他载体：其他载体：噬菌体、噬菌体、动植物病毒等动植物病毒等三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体-“-“分子运输车分子运输车”思考：噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是。病毒对宿主细胞的侵染具有一定的性。利用病毒对宿主细胞的侵染性物种特异若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用作为载体，其原因是。噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕种类用途不同点质粒噬菌体植物病毒动物病毒将外源基因导入细菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别4.种类：质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体-“-“分子运输车分子运输车”鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞标记基因标记基因的作用的作用导导思考思考讨论：讨论：重组重组DNADNA分子分子请你在上述序列中找到请你在上述序列中找到EcoEcoRR的识别序列和切割位点的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行。然后，用剪刀进行“切切割割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNADNA链上切下的片段重组到上面那链上切下的片段重组到上面那条条DNADNA链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。链的切口处，并用透明胶带将切口粘起来。35注：注：选择限制酶的要求选择限制酶的要求 选目的基因两端和载体都有的酶切位点，确保出现相同的黏性末端选目的基因两端和载体都有的酶切位点，确保出现相同的黏性末端 所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因所选酶切位点不能破坏目的基因和标记基因 选择两种限制酶的优点：防止目的基因和载体选择两种限制酶的优点：防止目的基因和载体自身环化、反向连接自身环化、反向连接361.“分子手术刀”1）来源：2）作用：3）作用结果：2.“分子缝合线”1）作用：2）分类：3.“分子运输车”1）作用：2）种类：3）应具备条件：限制酶产生黏性末端、平末端DNA连接酶将不同的DNA片段连接起来磷酸二酯键磷酸二酯键将外源基因送入受体细胞质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒E.ColiDNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）主要从原核生物中分离纯化出来。载体识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。作用部位：作用部位：能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。有一个至多个限制酶切割位点具有标记基因对受体细胞无害便于重组DNA分子的筛选供外源DNA片段（目的基因）插入其中小结：基因工程的基本工具四、探究实验四、探究实验:DNA的粗提取和鉴定【探究与实践】【探究与实践】DNA的粗提取与鉴定材料用具1.选材：DNA含量的生物组织，相对较高如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）2.试剂：研磨液破坏细胞，释放出细胞内的物质体积分数为95%的酒精 析出DNA2mol/L的NaCl溶液溶解DNA二苯胺试剂鉴定DNA（要现配现用）蒸馏水（洗涤剂和食盐）方法步骤1.破碎细胞称取，切碎，放入研钵，倒入，研磨。洋葱研磨液充分【思考】【思考】如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？如果研磨不充分会对实验结果产生怎样的影响？研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。2.去除杂质在漏斗中垫上过滤研磨液，4冰箱中静置后取；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取。纱布上清液上清液【思考】【思考】过滤过滤能否用滤纸代替纱布能否用滤纸代替纱布？不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。方法步骤3.DNA的粗提取【思考】【思考】此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。在上清液中加入体积相等的溶液,静置23min，溶液中出现的就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物【思考】【思考】此步骤的目的是？此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。【拓展】预冷的酒精的优点可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。析出DNA方法步骤析出DNA3.DNA的粗提取用玻璃棒沿搅拌，卷起，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取晾干。一个方向沉淀物【思考】【思考】为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？避免破坏DNA4.DNA的鉴定取20mL的试管，各加入的NaCl的溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中加入4mL的试剂。混合均匀后，将试管置于中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中颜色的变化。实验组对照组2mol/L二苯胺沸水丝状物两支结果分析与评价1.如果提取出来的不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。2.DNA与二苯胺试剂呈，颜色的深浅与有关。蓝色DNA的含量考点注意1.如果使用离心方法，共有2次离心：第1次取上清液，第2次取沉淀物。2.如果低温静置后取上清液，后加入遇冷酒精再静置，溶液出现白色丝状物即粗提DNA。DNA+二苯胺蓝色沸水加热练习与应用一、概念检测2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（）A.大肠杆菌的质粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用来识别特定基因的DNA探针A二、拓展应用2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的DNA片段相连接?为什么?Xba因为Xba与Spe切割产生了相同的黏性末端