提取测定淡水藻中叶绿素a的方法研究_万修志_1_2_1叶绿素a提取方法进展_10.docx
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1、山东建筑大学硕士学位论文 化、生态等方面研究的必要手段,其测定方法很多,有测干重法、叶绿素法、 浊度法、最大比生长速率法等,应用最多的是测叶绿素 a法。 叶绿素 a是水生态调查中必不可少的调查项目,是反映浮游植物生物量乃 至初级生产力水平的最直接有效的指标。浮游生物和水藻等活体生物的分布和 数量可以反映该区域的生态状况。浮游植物长期以来就被用作水质的生物指标, 特别对于大量水体及大面积水域而言,测定浮游植物的物种和数量,对水质评 价有着更为重要的实用意义。研究人员可以根据对浮游生物和水藻的总数和分 布的了解,就可以得出有关该水域水质状况、生物构成以及生态状况等信息, 而叶绿素是现场观测中必不可
2、少的测量参数。 本课题主要针对引黄供水系统的藻类污染特征,进行水质污染特性识别, 以及在线监测水藻等关键技术的研究,并在济南引黄供水系统进行应用示范。 探寻淡水藻中叶绿素 a的提取及测定新方法,使方法简便快捷、灵敏度高、准 确度好,且易于现场操作,最终实现在线监测。本课题的研究与应用将为引黄 供水系统水质风险识别及饮用水安全保障能力评估指标体系的构建提供有力的 技术支撑,因此本项目具有显著的经济、社会和环境效益。 1.2叶绿素 a提取及测定方法进展 1.2.1叶绿素 a提取方法进展 目前应用较多的叶绿素 a提取方法主要有:直接浸泡提取法,浸泡研磨提取 法和超声波浸泡提取法。 1.2.1.1直接
3、浸泡提取法 将藻类直接放入提取剂中浸泡提取叶绿素 a, 是最简单、也是应用最广泛的 提取方法之一,提取液再经分光光度法或者荧光法进行测定。常用的光合色素 提取试剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、 DMF等,其中丙酮是目前最常使用于定量 测定叶绿素 a浓度的提取液,对各个种类浮游植物的叶绿素 a均有综合能力很强 的提取效果。 1.甲醇 (Methanol) 虽然目前国内外在色素提取溶剂的选择上最常用的仍然是丙酮,但丙酮也 不是万能的,例如在提取某些蓝藻和绿藻时就不如甲醇,并且甲醇对某些浮游 植物色素的提取比丙酮更迅速、更完全。但是 1985年 Bowles和 Hains研究发现对 于某些淡水藻如蓝藻中
4、的铜绿微囊藻、鱼腥藻、绿藻小球藻和硅藻来说,纯丙 山东建筑大学硕士学位论文 酮或丙酮:甲醇 =1 : 1的混合液的提取效率明显高于 90%或者纯甲醇。之后研究 人员还发现不同提取试剂对不同色素的提取效率有差异,而且没有一种复合试 剂对所有色素都适用。 1999年 Zapata和 Garrido在研究色谱一致性时发现用甲醇 提取极性色素时,会产生更尖锐的色谱峰 9。研究发现大多数色素在使用丙酮: 甲醇 =1 : 1的混合液或 90%丙酮为提取溶剂处理样品的提取效果较好。所以,目 前在研究色素提取过程中,甲醇已经很少被作为主要的提取溶剂使用。 2. 乙醇 (Ethanol) 在迄今已知的色素提取溶
5、剂中,乙醇是最安全的提取溶剂,但多被用于提取 淡水浮游植物的色素,对海洋浮游植物的提取应用较少。 1978年 Moed等研究表 明乙醇与甲醇提取效率相似,但 Arvola认为乙醇略差于甲醇 1Q。 1984年Sartory 和 Grobbelaar研究发现 90%乙醇和加入沸腾的纯甲醇提取一些淡水浮游植物叶 绿素时效果明显优于 90%丙酮和丙酮 -DMSO等体积混合溶液。 1987年 Jespersen 等在提取淡水浮游植物色素时,发现室温提取 6h时乙醇的提取效率与甲醇相当, 但当提取大型海藻时,就必须使用更长时间甚至要加热。而 2000年陈宇炜等用 80C90% 热乙醇 于 80C 水浴萃
6、取淡水浮游植物并与 Lorenzen单色丙酮提取法进 行比较,热乙醇法的测定结果明显高于丙酮法,而且标准偏差也较低。章宗涉、 张如美等人认为应该用乙醇代替丙酮提取叶绿素 a, 其两者提取效果相似且乙醇 的安全性高。 3. 丙酮 (Acetone) 1940年, Mackinney首先提出用丙酮做提取剂,并给出了叶绿素 a和 b的消光 系数,对叶绿素 a的提取做出了重大突破。 1941年,他又用 80%丙酮作溶剂提取 燕麦和锦葵中的叶绿素 a和 b, 并研究出从 425-680nm波长下的叶绿素 a和b的消光 系数,并得出以下结论:叶绿素 a的最大吸收峰为 663nm, 叶绿素 b的最大吸收 峰
7、为 645nm。 1949年, Amon用 80%的丙酮来提取菠菜苗的叶绿素并进行分光光 度法的测定,迄今为止,这个方法在国内外仍被广泛应用。 1952年,Richard等 用丙酮将样品浸泡 911测得叶绿素 a、 b和 c。 1960年 Vemon用 80%丙酮作溶剂用分 光光度法测定叶绿素 a、 叶绿素 b和脱镁叶绿素 a、 脱镁叶绿素b, 并得出了计算 公式。后来又经 Humphrey和 Wooton在 1966年证实 90%两酮是提取海洋浮游植物 中叶绿素的一种理想溶剂。 1966年国际海洋研究科学委员会 (SCOR-UN-ESCO) 推荐使用将样品浸泡于 90%丙酮中低温过夜提取的方
8、法 11,用丙酮和 90%丙酮 山东建筑大学硕士学位论文 作溶剂,测定叶绿素 a、 b和 c的吸收光谱的方法被广泛采纳, Jeffery和 Humphrey 研究出了计算叶绿素的光谱经验公式,并被后人所证实。到目前为止,以 90%丙 酮为溶剂的方法仍然在广泛使用。 4. 二甲基亚砜 (Dimethylsulfoxide,DMSO) 1979年 Hiscox等用 65 C的 DMSO浸泡提取天竺葵、柠檬和豌豆的叶片以及 欧洲赤松松针的叶绿素,提取结果与 90%丙酮研磨法相当,并且叶绿素在 DMSO 中可稳定 5d以上。此法操作简单,溶剂浸透性强,引起了研究者的广泛关注。1976 年 ShoafS
9、lLium的研究表明从硅藻和蓝藻中提取叶绿素时,发现 DMSO与 90%丙 酮的提取效果相当,但在提取绿藻时 DMSO表现得就比 90%丙酮优秀,对不同 种的绿藻 DMSO提取效率比 90%丙酮高 2到 60倍。 1980年 Bumison在光谱分析中 发现将样品在 65 C DMSO中浸泡后用 90%丙酮淋洗的效果比 90%丙酮研磨或只 使用 DMSO研磨的效果好得多,且 DMSO与 90%丙酮研磨法间的偏差很小,混合 液用超声波处理后叶绿素测量值会增加 1/3。 20世纪 80年代此法在我国开始应用。 1984年胡文玉等用 DMSO在 65 C提取 菠菜叶的叶绿素的光谱与 90%丙酮提取液
10、的结果基本一致,吸收峰完全相符, 与Arnon法一样灵敏。但有人研究证明 65 C时叶绿素受高温破坏使测量值偏低, 而且 DMSO提取液与丙酮提取液的吸收光谱有差异 12,用丙酮法公式计算叶绿 素含量不妥。由于 DMSO气味难闻,粘度大,温度在 19 C下易结晶,限制了该 法的进一步推广。 5. N, N-二甲基甲酰胺 (N, N-dimethylformamide,DMF) 1968年 Volk和 Bishop使用 DMF从好酸性微细藻 Cyanidium中提取叶绿素。 1980年 Moran将 DMF用于黄瓜子叶叶绿素的提取,测定了叶绿素 a在 DMF中的光 谱图及 664.5nm处的消光
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