《一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法_张晓祥.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一种快速提取小麦基因组DNA的改良CTAB方法_张晓祥.docx(4页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、 中 农 f Ci 旅 2012?28(36):46-49 Chinese Agricultural Science Bulletin _种快速提取小麦基因组 DNA的改良 CTAB方法 张晓祥,王玲,寿路路 (江苏里下河地区农业科学研究所,江苏扬州 225007) 摘要: 旨在寻求一种微量、快速提取小麦 DNA的方法。以小麦幼叶为材料,用改良 CTAB法、改良SDS 法、沸水浴法提取小麦叶片总 DNA, 通过琼脂糖凝胶电泳法、紫外吸收法和 PCR检测 DNA完整性和纯 度。改良 CTAB法提取小麦基因组 DNA质量和纯度高、无降解,每人每天可以轻松提取 200个 DNA样 品,对转基因植株的
2、 PCR检测显示扩增目标条带清晰一致,无假阳性,试验结果理想。改良 SDS法所提 DNA纯度和浓度虽略不如改良 CTAB法,但仍然符合实验要求。沸水浴法提取量少且杂质多, PCR无 有效扩增,结果不理想。改良 CTAB法提供了一种简便、快速微量小麦 DNA提取方法,适用于 PCR和其 他分子生物学研究。 关键词 :小麦 ;DNA提取;改良 CTAB法 中图分类号 :S512.101, Q943.2 文献标志码 :A 论文编号 :2012-2712 A Rapid Modified CTAB Method of Extracting Genomic DNA from Wheat Leaf Zha
3、ng Xiaoxiang1, Wang Ling1, Shou Lulu1 Agricultural Science Institute of the Lixiahe District, Yangzhou Jiangsu 225007) Abstract: The aim was to seek for a rapid DNA miniprep extraction method from wheat leaves. The wheat leaves were used as experimental materials, total DNA was extracted by using me
4、thods including modified CTAB, modified SDS and Boiling. Integrality and purity of nucleic acids were detected with agarose gel electrophoresis, ultraviolet absorption and PCR. DNA quality and purity extracted by modified CTAB method were high and had no degradation phenomenon. Two hundred DNA sampl
5、es could be extracted each workday by per capita using this method. PCR detection of wheat transgenic plants showed that amplified bands of target gene were clear, without false-positive, and the test results were satisfactory. The DNA purity and concentration extracted by modified SDS method were n
6、ot as good as modified CTAB method, but it also met the DNA requirements of major molecular research. The DNA quantity extracted by modified Boiling method was small and had a lot of impurities in it, PCR detection of this DNA showed no amplified band, the test results were unsatisfactory. Modified
7、CTAB method provided a simple, rapid and miniprep method for extracting DNA from wheat, and was suitable for PCR amplification and other molecular biology research. Key words: wheat; DNA extraction; modified CTAB method 引言 植物 DNA提取是分子生物学研究中最基本的操 作,提取 DNA的质量至关重要,它直接影响后续实验 的进行 1_2。目前己发表多种从植物中提取 DNA的方
8、法,如 SDS法 3和 CTAB法 4,分离的 DNA质量、纯度 都较高,符合 PCR检测的要求,但这些方法步骤复杂, 降低了分子标记检测效率,影响了分子标记技术的普 及和推广 5_7。近年来也发展了多种简易提取 DNA的 方法,如碱处理法 8、高温水煮法 9、 SDS 步法1 、 TE 研磨法 11等,这些方法大都速度快、成本低,避免使用 基金项目 : UI家转基因屮物新品种培育重大专项 “ 抗病虫转基因小麦新品种培育 ” (2011ZX08002-001); “ 抗逆转基因小麦新品种培育 ” (2011ZX08002-002);江办省农业科技支撑 “ 优质高产多抗专用小麦新品种选育 ”(
9、BE2011306);江办省 H+I创新资金 (CX(12)2026)。 第一作者简介: 张晓祥,男, 1979年出生,江苏姜堰人,助理研究员,硕士,主要从事小麦遗传育种研究。通信地址 : 225007扬州市扬子江北路 568号 江苏里下河地区农业科学研究所, Tel: 0514-87636763, E-mail: 。 收稿日期: 2012-08-03, 修回日期: 2012-10-24。 张晓祥等:一种快速提取小麦基因组 DNA的改良 CTAB方法 47 . 液氮 、苯酚 13_14等试剂 ,甚至将研磨破碎后的提取液 直接用做模板,但是存在着 DNA提取质量差、常常不 能扩增出目的片段等问题
10、 15_16,这些简易法在转基因分 子检测等需要制备大量高纯度 DNA时仍然受到限 制。本研究在传统植物基因组 DNA提取方法的基础 上摸索出一种高质量小麦基因组改良 CTAB快速提取 方法,该方法与其他改良方法相比利用组织研磨仪无 需人工,不使用液氮和苯酚,能有效去除蛋白质 、 RNA 和多糖 ,DNA提取质量高,并对转基因植株进行 PCR 检测验证,获得了理想的扩增效果。 1材料与方法 1.1材料 以江苏里下河地区农业科学研究所育成 43份转 基因新品系幼苗叶片为材料。 1.2试剂 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 mol/L NaCl, 500 mmol/L
11、EDTA, 10% SDS (pH 8.0), 1 mol/L NaOH, 酚 :氯仿 (1:1), 氯仿 :异戊醇 (24:1),异丙醇,乙醇 (70%和 100%), 1 xTE 缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA,pH 8.0),琼脂糖 (0.8%、 1.5%);溴化乙锭。 1.3主要仪器设备 研磨仪 ( TKI Geno2000),高速离心机 ( Sigma 1-14),紫夕卜 /可见光分光光度计 (Thermo heroes 7),电泳 槽(北京六一 DYCP-31),电泳仪(北京六一 DYY-6), PCR 仪 (ABI Veriti),
12、凝胶成像系统 (Bio-rad Gel Doc) 等。 1.4实验方法 1.4.1新方法(改良 CTAB法)在 1.5 mL的离心管中加 入 600 CTAB提取液 ( 10 g CTAB溶于去离子水,加 入 50 mL 1 mol/L 的 Tris-HCl, 280 mL 2.5 mol/L 的 NaCl, 1 mL 巯基乙醇和 20 mL 0.5 mol/L 的 EDTA-Na, 定容至 500 mL);取小麦幼苗叶片 ( 长度为 23 cm)放入缓冲液中,加 1枚小钢珠,研磨仪以 1400 strokes/min速度研磨 1.5 min;在 65T; 水浴保温 2030 min, 加入
13、600 (xL氯仿 :异戊醇 (24:1),充分摇匀 后冰上放置 10 min,以12000 r/min的速度离心 5 min, 将上清液转入另一离心管;加入与上清液等体积的氯 仿摇匀,以 12000 r/min的速度离心 5 min,将上清液转 入另一离心管(若上清液澄清 ,可省略此步骤 );加入与 上清液等量的异丙醇摇勻,在 -20T下保存 30 min,以 12000 r/min的速度离心 5 min;小心倒掉上清液 沉淀 用 70%乙醇洗涤 12次,每次高速离心 30 s, 倒掉乙 醇,在室温下干燥 DNA, 加 200吣 lxTE或灭菌的 ddH20溶解,4丈保存备用。 1.4.2改
14、良 SDS法在 1.5 mL的离心管中力口入 600 pL SDS 提取液(加入 50 mL 1 mol/L 的 Tris-HCl, 100 mL 2.5 mol/L 的 NaCl, 400 卟 巯基乙醇和 50 mL 0.5 mol/L 的 EDTA-Na, 100 mL 10% SDS,定容至 500 mL);取小麦幼苗叶片 ( 长度为 23 cm)放入 缓冲 液中,加 1枚小钢珠,研磨仪以 1400 strokes/min速度研 磨 1.5 min;在 65T: 水浴保温 2030min, 加入 600吣 酚 :氯仿( 1:1),充分摇匀后冰上放置 10 min,以 12000 r/mi
15、n的速度离心 5 min,将上清液转入另一离心 管;加入与上清液等体积的氯仿摇勻,以 12000 r/mm 的速度离心 5 mm,将上清液转入另一离心管 (若上清 液澄清,可省略此步骤 );加入与上清液等量的异丙醇 摇勻,在 -20T; 下保存 30 min,以 12000 r/min的速度离 心 5 min;小心倒掉上清液 沉淀用 70%乙醇洗涤 1 2 次 ,每次高速离心30 s,倒掉乙醇 ,在室温下干燥 DNA, 加 200 lxTE或灭菌的 ddH20溶解, 4丈保存备用。 1.4.3沸水浴法(研磨 ) 在 1.5 mL的离心管中加入 600 LNaOH提取液(加入 50 mL 1 m
16、ol/L 的 Tris-HCl, 20 mL 2.5 mol/L 的 NaCl, 400 巯基乙醇和 50 mL 0.5 mol/L 的 EDTA-Na, 100 mL 10% SDS, 50 mL 1 mol/L的 NaOH,定容至 500 mL);取小麦幼苗叶片 (长度为 23 cm)放入缓冲液中,加 1枚小钢珠,研磨仪 以 1400 strokes/min 速度研磨 1.5 min;再加入 10 (xL 1 mol/L NaOH沸水浴 58 min;每管加入等体积的酚 - 氯仿混勻, 12000 r/min离心 5 min;取上清移入另一离 心管,加入等体积的氯仿混勻后, 12000 r
17、/mm离心 5 min;取上清,加等体积的异丙醇,轻轻混匀 23 min, 静置 10 min,12000 r/min 离心 5 min, 收集 DNA; 70% 乙醇洗 12次 ;在室温下干燥 DNA, 加 200吣 lxTE或 灭菌的 ddH20溶解, 4丈保存备用。 1.4.4沸水浴法(未研磨)除叶片不进行研磨外其余步 骤与沸水浴法研磨处理相同。 1.4.5 DNA浓度和质量检测由于 DNA在 260nm处有 最大的吸收峰,蛋白质在 280 nm处有最大的吸收峰, 盐和小分子则集中在 230 nm处,采用紫外 /可见光分 光光度计,测定 DNA样品的吸光值 (9A3。、 OA、 OA8。
18、 和 0A2。 较纯的 DNA OD26 / A8。比值应在 1.8左右, 低于 1.8说明提取 DNA中蛋白质可能未除尽; (926。 /0及 3。的比值应大于 2.0,小于 2.0说明样品被碳 水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染; A2。值是反 映提取液的澄清度,纯的 DNA数值应为 0。并按公 式 :DNA产量 (胆 /mL)=QA61)x5 x稀释倍数,计算 DNA 的产量。取 DNA 10吣,用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳, 通过凝胶成像系统检测 DNA的提取质量。 .48 . 中国表学通板 http:/ 1.4.6 PCR检测 MM基因引物序列为 Nib8F: 5-ATGATCAG
19、AATGTTGGAAGACGCCGGCC-3和 Nib8R: 5-GGAGCTCAATGCTGCTATCACCATAGT G-3 PCR 反应体系为 : 10 x PCR Buffer 2.5 私、 2.5 mmol/L dNTP 1.5 pL、 10 mmol/L Primer 各 1.0 jxL、 1 U Tag酶、 DNA模板 1.0 L、 ddH20补至 25 卟 。 PCR 反应条件为:首先 94丈预变性 5 min;然 后 94丈变性 1 min, 55退火 50 s, 72T; 延伸 1 min,共 35个循环 ;最后 72延伸 5 min。 取 12卟 扩增产物在 1.5%的加
20、入溴 化乙锭的琼脂糖凝胶上电泳分离,缓冲体系为 1 xTAE 溶液, 120 V电泳 45 min, 凝胶成像系统观察并拍照。 2结果与分析 2.1 DNA提取质量检测 4种方法提取的小麦 DNA质量和产量有较为明 显的差异。从 DNA样品的凝胶电泳图谱可看出,新方 法和改良 SDS法提取的 DNA条带清晰度和亮度较高 且一致, DNA完整性较好,改良 SDS法略有拖尾现象; 紫外可见光分光光度计测量新方法和改良 SDS法所 提取的 DNA纯度和产量基本接近, (926。 / 28。比值均 在 1.8 2.0之间,新方法 (9WOA3。 比值大于 2.0;表明 新方法提取质量为最好 ,SDS法
21、次之(图 1、表1)。 而沸水浴法对样品分别进行研磨和未研磨 2种处 理,其电泳图谱亮度与新方法和改良 SDS法相比较 淡,未研磨处理最淡,且均未跑出点样孔,可能是由于 杂质中蛋白与核酸结合堵住了点样孔造成的;此现象 与紫外可见光分光光度计测量结果一致,其 0W0A8 。、 比值明显低于 1.8和 2.0,说明 这 2种方法提取 DNA质量较差,杂质较多,尤其是沸 水浴法在研磨处理下 A6 / A8 。、 。 更 是 分 别低至 1.487和 0.81, 值 0.022也是最高,说明其 杂质最多,而沸水浴法未研磨处理提取的 DNA浓度则 最低 (表 1),表明沸水浴法虽然可以省略研磨步骤,节
22、省时间,但其提取质量较差,不太适合一些要求较高的 分子生物学研究。 M: Markers; 1 4:改良 CTAB法 ;5 8:改良 SDS法 ;9 12:沸水浴法 (研磨 ); 13 16:沸水浴法 (未研磨 ) 图 1不同方法提取的小 麦 叶片 DNA电 泳 图谱 表 1 4种 不同方法提取 DNA纯 度和 产 量 方法 OD260 ODiw OD230 OD320 DNA 浓度 / g/jaL) OD: 60/OD2S0 OD: 6 / OD230 新方法 0.115 0.058 0.054 0.002 0.229 1.993 2.123 改良 SDS法 0.104 0.055 0.05
23、3 0.003 0.208 1.875 1.948 沸水浴法 (研磨 ) 0.085 0.057 0.160 0.022 0.169 1.487 0.810 沸水浴法 (未研磨) 0.031 0.016 0.028 0.003 0.061 1.901 1.135 2.2 PCR验证效果 为了验证新方法提取的 DNA是 *满足 PCR检测 要求,利用转基因新品系按以上 4种方法分别提 取的 DNA为样品进行分子检测,山图 2可知,沸水浴 法研磨和未研磨 2种处理 PCR出现涂抹带或无扩增, 反复验证后偶有扩增条带且亮度较淡,说明沸水浴法 提取 DNA纯度较差,杂质会对 PCR扩增造成较大影 响;
24、而改良 CTAB法和 SDS法扩增条带较亮,改良 CTAB法样品间扩增一致性好于 SDS法,说明改良 CTAB法能够快速提取高质量的 DNA, 完全能够适用 于分子生物学后续研究。 3结论 该方法在提取液加钢珠在组织研磨仪上以 1400 strokes/min高速振荡研磨,无需使用液氮和苯 酚,极大提高了处理速度, 100份样品 1 2 mm内可研 磨处理完成,结果显示高速振荡也不会因为过强机械 张晓祥等:一种快速提取小麦基因组 DNA的改良 CTAB方法 49 M: Markers; 1 4:改良 CTAB法 ;5 8:改良 SDS法 ;9 12:沸水浴法 (研磨 ); 13 16:沸水浴法
25、 (未研磨 ) 图 2不同方法提取的 DNANib8基因检测结果 张力导致 DNA断裂 ,DNA完整、未出现涂抹带 ;DNA 提取质量和纯度好, DNA得率与 SDS法相当, (928。和 026。 /023。比值均接近理想状态 ;对转基因植 株的 PCR检测显示扩增目标条带清晰一致,无假阳 性,证明该方法是一种高质量的简便快速小麦 DNA 提取方法。改良 SDS法提取效果及扩增结果与新方 法相比略差,也是一种较好的 DN A提取方法。沸水 浴法提取量少且杂质多 , P C R无有效扩增,结果不理 想,不能用于小麦转基因检测等对 DN A要求相对较 尚的研究。 4讨论 分子生物学的发展,对植物
26、 DNA提取技术的要 求是快速、简便 1_2。本研究对传统 DNA提取方法改 良进行探索 5_7,与传统 CTAB法相比,简化了步骤,避 免使用苯酚,嫩叶片一般只需氯仿抽提 1次即可, DNA带型完整,没有涂抹带,也无 RNA污染,说明 DNA完整性良好。所需样品少,不需使用研钵研磨, 对样品要求也不高,经笔者试验老叶片增加一次氯仿 抽提,提取 DN A质量与嫩叶差别也不大。新方法提 取 DNA质量和 PCR扩增结果均好于改良 SDS法5a2, 改良 SDS法 DNA电泳有少量拖带,样品扩增一致性 略差于改良 CTAB法,该现象与前人研究相同 ,但其 DN A得率高于 S D S法与前人研究有
27、所不同;而沸水 浴法 DNA提取量较少,提取后杂质较多,出现DNA 电泳时无法跑出点样孔现象,可能是山于蛋白与核酸 结合导致 17;存在 PCR无有效扩增的现象 il5_16,与部 分前人研究结果相同,说明其稳定性差。试验结果表 明,当需要进行大通量的分子检测时,用这种改良的 C TAB法无需使用液氮和苯酚,可以大大节省时间, 1 人 1天可以轻松提取 200份以上样品,并目 .需要材料 量少、成本低、得率高、纯度好,可用于 PCR等分子生 物学研究的需要。 参考文献 1 董建力 .王敬东,惠红霞,等 .小麦幼叶 DNA微量快速提取方法的改 进J.麦类作物学报, 2007,27(3):475-
28、478. 2 田再民,龚学臣,季伟 .小麦 DNA提取方法的比较 J.河北北方学院 学报 ,2009,25(4):22_25. 3 Kauflnan B, Richards S, Diefig D A. DNA isolation method for high polysaecharide Lesquuerella species J. Industrial Crops and Products, 1999,9(2): 111 _ 114. 4 Tel-Zur N, Abbo S, Myslabodski D, et al. Modified CTAB procedure for DNA i
29、solation from epiphytic cacti of the genera hylocereus and selenicereus(Cactaceae)J.Plant Mol Bio Rep, 1999, 17(3):249-254. 5 思彬彬,张超 ,徐如宏,等 .小麦基因组 DNA改良提取方法的探讨 J山地农业生物学报 ,2005,24(2): 142-145. 6 师丽红,杨文香 ,刘大群 .小麦基因组的一种简易提取方法 J.中国 农学通报 ,2 1 ,26(19):22-26. 7 柴建芳,刘旭 ,贾继增 .一种适于 PCR扩增的小麦基因组 DNA快速 提取法 J.植物遗
30、传资源学报 ,2006,7(2):246-248. 8 Klimyuk V I, Carroll B J, Thomas C M, et al. Alkali treatment for rapid preparation of plant material for reliable PCR analysis J. Plant J,1993,3(3):493-494. 9 Thomson D, Henry R. Single-step protocol for preparation of plant tissue for analysis by PCRJ. Biotechniques, 19
31、95,19(3):394-400. 10 王会文,吴璨 ,赵晓瑜,等 .SDS 步法制备 PCR模板 J.河北农业学 报 ,2002,22(2):186_188. 11 王兰,龙云铭 ,刘耀光 .一种用于 PCR的植物基因组 DNA快速制备 方法 J.分子植物育种 ,2009,7(2):425-428_ 12 刘鹏,邱晓东 ,郭智慧,等 .小麦幼叶 DNA快速提取新方法及 SSR-PCR 扩增 J.江苏农业科学 ,2011,39(4):36-37. 13 王敏,那冬晨 ,姬虎太,等 .快速小量提取小麦叶片 DNA的一种简易 方法 J.安徽农业科学 ,2009,37(35):17384-17385. 14 杨芳,尚勋武 ,王化俊,等 .小麦基因组 DNA快速提取及 SSR标记 PAGE的银染检测 J.甘肃农业大学学报 ,2008,43(2):46-50. 15 楼巧君,陈亮 ,罗利军 .三种水稻基因组 DNA快速提取方法的比较 J.分子植物育种 ,2005,3(5):749-752_ 16 许明,程祖锌 ,黄志伟,等一种适于转基因水稻 PCR检测的微量 DNA快速提取法 J.生物技术通报 ,2010(3):128-130 17 袁澍,王晓强 ,牟林春,等 .为什么点样孔会发亮 J.生物学通报 , 2005,40(4):54-55.
限制150内