细胞的裂解(共1页).doc
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1、精选优质文档-倾情为你奉上组织培养细胞的裂解 对于组织培养中生长的细胞,最有效的裂解方法是用去污剂进行处理。虽然有多种去污剂可用于裂解细胞,但最常用的是TritonX100或NP40等非离子型去污剂。非离子型去污剂能溶解胞质和细胞膜,破坏分子间许多微弱的结合键,并能溶解大部分经常研究的蛋白质抗原,但对于大分子多聚抗原则无效,在大多数情况下该抗原也是难以研究的。浓度介于011的去污剂即可满足几乎所有溶解需求。非离子型去污剂裂解液一般补充等离子浓度的盐和接近中性的pH。 在某些情况下,需要较剧烈的抽提条件以释出所研究的抗原或除去微弱的相关蛋白。此时,推荐使用RIPA裂解缓冲液,该体系含离子型和非离
2、子型去污剂,具有相当大的变性能力。除细胞内不溶性蛋白外所有可溶性蛋白分子均可释出,并能破坏大部分非共价的相互作用。 除非有特殊原因,推荐在裂解缓冲体系中加入蛋白酶抑制剂混合液。在新抗原研究的早期使用蛋白酶抑制剂总是有利的。在该蛋白已被定性后,可以进行实验以了解这些抑制剂是否在所有情况下都必需。如前所述,终止蛋白酶作用的最好方法是在免疫沉淀的全部过程中溶液保持低温。 如果研究经磷酸化修饰的时,应考虑加入磷酸酶抑制剂。 1准备工作 由于免疫沉淀有多个步骤,且包括数小时孵育,因此在实验开始前必须安排好时间,注意适当利用过夜孵育的时间间隔。这将有助于决定何时开始裂解细胞。 2所需溶液 PBS,裂解缓冲
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