免疫组织化学分析.docx
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1、免疫组织化学分析(1) 脱蜡和水化:脱蜡前首先将组织切片在65恒温箱中烘烤20 min;之后将组织切片依次浸泡二甲苯(3次),每次10min;然后再依次浸泡无水乙醇(2次)、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇、双蒸水,各3 min完成脱蜡和水化,蒸馏水冲去玻片上的酒精。(2) 抗原修复:将枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)倒入不锈钢高压锅中;待溶液沸腾后将玻片置于塑料染色架,缓慢放入锅中,使玻片完全浸没于缓冲液,将盖子锁定,待阀门中有高压蒸汽喷出后,计时2 min,关掉热源。自然冷却至室温,约需11.5 hr。+PBS洗3次,每次3min.(3) 封闭内源过氧化物酶活性:
2、将3% H2O2(现用现配)滴在玻片组织上,放入湿盒内,室温静置2030 min。PBS洗3次,5 min/次。(4) 抗原封闭:将5% BSA(0.5gBSA粉末定容到10mlPBS)滴在玻片组织上,放入湿盒内,室温静置2030 min。(5) 抗孵育:用5% BSA稀释抗体至说明书指定终浓度,将稀释好的抗体50 l100 l滴加至组织上,放入湿盒内,4过夜。PBS洗3次,5 min/次。(6) 抗孵育:滴加抗孵育液4050 l至组织上,放入湿盒内,室温静置20 min。PBS洗3次,5 min/次。(7) DAB显色:A,B液配置比例为50:1,即取1 ml A液,加入1滴B液,混匀即可。
3、将显色液加在组织片上,35 min,在显微镜下掌握染色程度。 (8) 自来水冲洗10 min。 (9) 苏木精复染0.51 min。(10) 自来水冲洗1015 min。 (11) 脱水和透明:将组织切片依次浸泡60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇(2次,2min/次)、二甲苯(3次,5 min/次)。 (与脱蜡、水化过程相反)(12) 中性树脂胶封片:切片从二甲苯中拿出后,勿干片,迅速滴加1滴中性树脂胶在组织片一侧,缓慢放平盖玻片,注意勿使有气泡,若有气泡覆盖在组织上,用二甲苯洗去盖玻片,重新封片。(13) 镜检及统计分析:ISL-1在组织中的染色强度可分为:阴性(阳性细胞比例75%)。评分分别表示为0、1、2、3。阳性率计算为阳性(2)和强阳性(3)例数所占总例数的百分比。染色强度与临床病理参数的相关性分析应用SPSS软件及c2检测进行统计。图像应用 Leica DM25000B 显微镜(Leica, Germany)进行采集。
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