利用短片段同源替换(SFHR)技术进行位点特异修复CHO细胞中游离的.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流利用短片段同源替换(SFHR)技术进行位点特异修复CHO细胞中游离的.精品文档.利用短片段同源替换(SFHR)技术进行位点特异性修复CHO细胞中游离的缺陷型EGFP基因生命科学学院 00级 贺晓路摘要传统的基因治疗主要采用基因扩增(gene augmentation)的策略,即向细胞中导入正常的靶基因表达序列,补偿细胞中缺陷型靶基因的功能。基因添加策略在遗传疾病的治疗中存在着严重的缺陷,从而限制了其临床应用。近年来发展起来的位点特异性基因修复(Site-specific Gene Correction)技术,如短片段同源替换技术(Small
2、DNA Fragment Homologous Replacement,SFHR),克服了基因添加策略的缺点。位点特异性的基因修复技术源于对同源重组(Homologous Recombination )的研究,即通过导入与正常靶基因同源的DNA短片段,通过细胞中的DNA修复或者同源重组的机制,特异性地修复缺陷型靶基因中的突变。利用位点特异性的基因修复技术不仅可以修复靶基因中存在的突变,而且能够在基因组中引入突变,因而在基因治疗和基因功能研究方面具有巨大的应用前景。目前,国际上关于短片段同源替换技术的研究处于实验阶段。本文中,我们利用短片段同源替换技术在中国仓鼠卵巢(Chinese Hamste
3、r Ovary ,CHO)细胞中对特异性修复染色体外游离基因的可能性进行了探索性的研究。我们利用绿色荧光蛋白报告基因作为检测系统,可以在荧光显微镜下灵敏地观察到经特异性修复后具有绿色荧光的细胞,并可以进一步通过FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)定量检测基因转变的效率。实验结果表明:在利用最适浓度的阳离子脂质体Lipofectamine2000(LF2000)转染的条件下,我们将载体上绿色荧光蛋白基因(Enhanced Green fluorescent Protein gene, EGFP)的第58位色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子(TAG)
4、,能成功地终止绿色荧光蛋白的表达。分别将带有第58位色氨酸密码子(TGG)的DNA片段FG1(393 bp)和FG2(695 bp)与上述含有缺陷型EGFP基因的载体用最适浓度的LF2000共转染CHO细胞后,用荧光显微镜皆能灵敏地检测到回复绿色荧光的细胞。进一步用FACS分析,确定了FG1和FG2介导基因转变的细胞的比例,证实了FG1和FG2分别修复了载体中缺陷型的绿色荧光蛋白基因EGFP。关键词短片段同源替换,位点特异性基因修复,同源重组,基因打靶1.引言传统的基因治疗其实是一种基因扩增(Gene Augmentation)机制,即通过载体系统将正常基因导入,使正常蛋白在转染的细胞里表达,
5、从而达到治疗的目的。这种方法的缺点是【1,2】:(1)为了使转入的正常基因长期有效表达,需要将外源的基因整合进入宿主细胞基因组,但是传统的方法可能导致发生较高频率的非同源重组,随机插入的DNA片段可能引起细胞基因组的功能紊乱;(2)如果采用非病毒载体,载体的大小限制了那些保证转基因适量表达的重要调节因子的载入,cDNA的大小受限制,构建载体比较困难,而且转化较大的载体不容易进入细胞内;(3)若采用病毒载体,转基因所引入的病毒成分可能引起免疫反应,从而造成转基因失败;(4)这种传统的基因治疗方法只能用于治疗隐形突变所造成的基因病;(5)成功率比较低,等等。这些限制使得人们寻找新的方法,而最新的方
6、法是用基因打靶(Gene Targeting)的方法对突变位点进行直接的基因修复(Gene Correction)。短片段同源替换(Small Fragment Homologous Replacement,SFHR)是一种改进的基因打靶策略【9】,它源于同源重组,是将与靶基因序列同源的400-800nt的单链DNA(single-strand DNA, ssDNA)或者双链DNA(double-strand DNA, dsDNA)导入细胞,该DNA片段中含有特定的错配碱基、一个或几个碱基的缺失或者插入,用来更正基因组序列中的原一个或者多个核苷酸突变【3-5】。如下图所示:图1、SFHR技术修
7、复基因可能的机理1.以靶基序列为模板、对其两端分别设计上游引物(forward primer , FP)和下游引物(reverse primer, RP ), 通过PCR扩增得到400-800bp的同源dsDNA短片段;然后通过热变性得到相应的ssDNA,转染入细胞。2. ssDNA进入细胞核,同细胞基因组作用,形成D-loop结构,并且与之发生重组和交换;3.内源性的基因修复使得基因组DNA序列更正为与ssDNA相同。而SFHR作为一种利用基因打靶进行基因治疗的策略,它具有一系列优于上述传统的基因扩增的特点【1,2】:(1)进入的短片段DNA分子在体内进行直接的基因更正可以使基因保持在它原本
8、的调控因子的控制下,不会影响细胞基因组的正常功能;(2)小分子的更正分子相对于质粒运载系统来说,可能增加向细胞以及细胞核转运的成功几率;(3)基因治疗一般用的是合成的小分子,不会引起免疫反应(Krieg AM等,2001);(4)它不仅仅可以治疗隐形突变引起的基因病,还可以治疗显性突变引起的基因病;(5)基因替换具有比较高的效率(达1-10%),而表型的维持并不需要100%的更正,因而有效和永久性的基因修复可以用更少甚至一次治疗就达到目的。SFHR的具体机理尚不清楚,但是它是源于同源重组发展起来的一项技术,似乎与同源重组有着相似的途径,例如应该都包括必要的基因校正,重组酶系统都引起媒介结构的生
9、成,以及随后的单链插入和核苷酸的交换。但是具体的机理还有待澄清。同源重组(Homologous Recombination)是指序列相似的DNA间交换遗传信息的过程。该技术已经被用于产生多种品系的转基因小鼠,提供了大量的遗传代谢疾病的模型(Mller U,1999)。然而,在体外实验利用同源重组修正遗传突变,效率非常低,仅10-5左右,并且通常伴有相等或者更多几率额外突变事件和非同源事件【5】。短片段同源替换技术能够在哺乳动物细胞中产生位点特异的基因转变,效率达到0.120。并且短片段同源替换技术不仅仅局限于改变靶基因的单个碱基,它能够同时改变多个碱基以及同时在靶基因的多处位点产生基因转变。同
10、时,它不但可以用于修正缺陷型基因,还可以在基因组引进突变,从而为基因功能的研究提供一个有力的工具。目前,国际上对SFHR技术的研究尚处于实验阶段,但是已经取得一些成功的研究成果。例如:在人的上皮毛孔细胞(Human Epithelial Airway Cells)里,用SFHR对囊肿性纤维化跨膜传导调节蛋白基因(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene, CFTR )缺失三个碱基的突变型F508进行基因更正,效率可达到1【3,6,7】,而且可以在表型上表现出来;另外,以小鼠杜氏肌肉营养不良型基因(Duchenne Musc
11、ular Dystrophy)的点突变为靶位点,培养细胞用SFHR更正,经PCR分析,效率高达1520【3,6,7,8】。但是,目前国际上只有少数实验室从事短片段同源替换技术的研究,并且研究对象仅仅局限于囊肿性纤维化和杜氏肌营养不良遗传疾病的细胞系和动物模型。我们试图利用绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein Gene, EGFP)作为报告基因【10,12,14】在CHO细胞中进行短片段同源替换技术的初步研究,为在更加广泛的哺乳动物细胞以及小鼠胚胎干细胞中进行短片段同源替换技术研究奠定工作基础,并为研究基因功能和基因治疗提供新途径。我们采用靶向修复游
12、离的缺陷型EGFP的策略,可以灵敏地检测到EGFP基因修复的绿色克隆。首先,我们采用两步PCR的方法在EGFP基因中引入点突变,使绿色荧光蛋白的第58位色氨酸(W58,TGG)突变为琥珀型终止密码子(TAG)【11,13,15,16】,构建载体pEGFP(-)-C1。然后以pEGFP-C1为模板,通过高保真PCR分别扩增含有EGFP第58位色氨酸(W58,TGG)的双链DNA片段FG1(393 bp)和FG2(695 bp),同时;以pEGFP(-)-C1为模板,使用同样的引物通过高保真PCR分别扩增对照片段FA1(393 bp)和FA2(695 bp)。在24-well细胞培养板中使用阳离子
13、脂质体Lipofectamine2000(LF2000)分别将质粒pEGFP(-)-C1和DNA片段FG1、FG2、FA1或者FA2按照质量比1:5瞬时共转染CHO细胞。转染后用荧光显微镜观察,FG1、FG2与pEGFP(-)-C1共转染的细胞都有部分回复绿色荧光,表明FG1和FG2使CHO细胞中绿色荧光蛋白恢复了表达。进一步用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)【16,17】分析确定了FG1和FG2介导基因转变效率,证实了FG1和FG2分别修复了载体中缺陷型的绿色荧光蛋白基因。2.pEGFP(-)-C1载体的构建我们以质粒pEGFP-C1(Clon
14、tech)为模板,采用两步PCR定点突变方法,将EGFP基因编码序列中第58号色氨酸残基(W58)的密码子TGG突变为终止密码TAG(*),构建载体pEGFP(-)-C1。首先,用引物1U(5-CACGGGGATTTCCAAGTC-3)和引物6D(5-ACGAGGGTGGGCTAGGGCACGGGCA-3), PCR扩增出384 bp的上游片段P1;用引物6U(5-TGCCCGTGCCCTAGCCCACCCTCGT-3)和9D(5-CCTCTACAAATGTGGTATGGC-3)PCR扩增出672 bp的下游片段P2,P1和P2中都含有引入的点突变(TGGTAG)。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离
15、P1和P2,并切胶回收纯化(Wizard PCR Preps DNA Purification System, Promega)。取P1和P2大约各10 ng,混匀后作为模板,用引物1U和9D扩增出1031 bp的包含有W58无义突变突变的EGFP-基因片段P3,P3的两端分别含有限制酶切位点Nhe I和Hind III。上述PCR反应皆使用高保真Pfu DNA聚合酶进行。然后,取10 g pEGFP-C1和5 g片段P3分别进行Nhe I和Hind III双酶切。0.8%琼脂糖凝胶电泳分离pEGFP-C1和片段P3的酶切产物,分别回收3970 bp的pEGFP-C1酶切片段和761bp的P3
16、酶切片段。调节两者比例约为1:3,用DNA Ligation Solution I(DNA Ligation Kit Ver. 2, TaKaRa)进行连接反应,获得载体pEGFP(-)-C1。HSV TK poly AKanr/NeorPSV40SV40 orif1 oripUC oriSV40 poly APCMV IEMCSEGFP(-)P57 *58 P59CCC TAG CCC pEGFP(-)-C14.7 kbHSV TK poly AKanr/NeorPSV40SV40 orif1 oripUC oriSV40 poly APCMV IEMCSEGFPP57 W58 P59CCC
17、 TGG CCC pEGFP-C14.7 kb图2、 载体pEGFP-C1和pEGFP(-)-C1。3.pEGFP(-)-C1载体的鉴定我们用LF2000(4 g/each 24-well)将纯化后的pEGFP(-)-C1(2 g/each 24-well)转染CHO细胞。转染48小时后,荧光显微镜下没有观察到绿色荧光细胞(见彩版:彩图1),表明了EGFP基因中的W58无义突变(W58*58,TGGTAG)能够有效地终止EGFP的表达。4.DNA短片段的制备分别以pEGFP-C1和pEGFP(-)-C1为模板,使用引物1U和2D(5-AGGGTGGTCACGAGGGTGGGCC-3),进行高保
18、真(Pfu DNA聚合酶)PCR反应,扩增双链DNA片段FG1及其对照片段FA1。FG1和FA1均为393 bp,处于EGFP基因的编码序列中。除第58位氨基酸残基密码子的中心碱基(FG1:TGG,FA1:TAG)外,FG1和FA1的其余序列均相同。为了避免转染时模板的干扰,用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离并切胶纯化FG1和FA1(见图3),再分别以纯化后的FG1和FA1为模板,使用引物1U和2D,进行高保真PCR反应,大量制备FG1和FA1,并用Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)纯化,最终溶于无菌超纯水中。同理,分别以pEGFP-C
19、1和pEGFP(-)-C1为模板,使用引物1U和1D(5-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3),进行高保真PCR反应,以同样的方式可制备双链DNA片段FG2及其对照片段FA2,纯化(见图3)后最终亦溶于无菌超纯水中。FG2和FA2均为695 bp,处于EGFP基因的编码序列中,除第58位氨基酸残基密码子的中心碱基(FG1:TGG,FA1:TAG)外,FG2和FA2的其余序列均相同。图3、分离PCR反应所得DNA短片段的电泳图Lane1:FA1Lane2:FA2Lane3:Marker DL2000Lane4:FG2Lane5:FG1Lane6:pEGFP(-)-C15.DNA短片段的
20、鉴定我们利用LF2000(4 g/each 24-well)分别将纯化后的FG1、FA1、FG2、和FA2(2 g/each 24-well)转染CHO细胞。转染48小时后,荧光显微镜观察,结果表明:单独转染DNA片段FG1、FA1、FG2和FA2的CHO细胞均无绿色荧光。6. 靶向修复CHO细胞中游离的缺陷型EGPF基因6.1共转染含有缺陷型EGPF基因的质粒及DNA短片段我们按照表1,设计4个转染组合,各自使用24-well细胞培养板进行转染。转染后24小时,将每个孔中的细胞对应传至单个35-mm细胞培养皿中,相当于1:5传代。表1、不同的小片段DNA与pEGFP(-)-C1组合共转染CH
21、O细胞加样表组合12345共转染的小片段DNA(3g/each 24-well)FG1FA1FG2FA2空白对照共转染的质粒DNA(0.6 g/each 24-well)pEGFP(-)-C1阳离子脂质体(4g/each 24-well)Lipofectamine2000(LF2000)6.2荧光显微镜检测按照表1加样转染后48小时用荧光显微镜观察,我们在组合1和组合3中发现绿色荧光的CHO细胞,而在对照实验组合2、组合4和组合5中的细胞均无绿色荧光(见彩版I:图2图6)。6.3 FACS分析转染结果我们依然按照表1中的转染组合使用24-well细胞培养板进行转染,每个组合平行做三组实验。转染
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