ELISA方法诊断隐孢子虫抗原.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流ELISA方法诊断隐孢子虫抗原.精品文档.单抗介导的夹心ELISA方法的建立摘要:将纯化的隐孢子虫卵囊制备免疫原,经油相苗、水相苗共6次免疫,制备了兔抗安氏隐孢子虫抗体。提纯后用HRP标记IgG抗体,标记后的HRP浓度为1.4 mg/mL,IgG浓度为1.755 mg/mL,酶/抗体摩尔比为1.18。选用3B10单抗与酶标兔抗建立了夹心ELISA试验,单抗的最佳稀释度为1:200,酶标抗体的工作浓度为1:400800。在3种待检样品的处理方法中,以样品经超声波破碎后置液氮-37反复冻融后再检测,效果最好;乙醚脱脂处理后再同上处理,结果OD值稍
2、低;未经冻融处理的隐孢子虫卵囊液比同滴度的处理样品OD值显著偏低。夹心ELISA最低检出限为含100个卵囊/mL粪样。特异性试验表明:该方法对于同属于隐孢子虫属的猪小球隐孢子虫、鸵鸟隐孢子虫有较高的识别力,其OD值与牛C. andersoni接近,而卵囊浓度相同的鸡球虫和猪等孢球虫的OD值则显著偏低。引 言目前,隐孢子虫的诊断方法主要有直接镜检、染色镜检、免疫学方法(如ELISA和IFAT)及PCR方法等。目前研究较多的是免疫学方法和分子生物学方法。1990年Robert报道了检测牛粪便中卵囊抗原的ELISA方法,取得了较好的效果。目前,国外已有商品ELISA检测试剂盒。国内张西臣1996年报
3、道了双抗体夹心ELISA检测病原的初步研究,尹继刚应用双夹心-ELISA对60份牛粪便样本检查,并与抗酸染色法比较发现, ELISA敏感性比抗酸染色强,且不与牛球虫、结肠小袋虫发生类属反应。作者在前两个试验的基础上,初步进行了夹心ELISA试验,为今后制备诊断试剂盒,用于水源、环境中隐孢子虫的检测做前期的准备。1.材料与方法1.1材料1.1.1单抗与多抗抗牛源安氏隐孢子虫的单克隆抗体制备见实验二,使用的为其中的3B10单抗,上清效价为6400,腹水效价为102400。多抗为兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体,琼扩效价为1:8。酶标单抗和酶标多抗均为自己标记。酶标羊抗鼠二抗购自北京中山金桥生物公司。1.1
4、.2实验动物健康无隐孢子虫的雄兔和雌兔各一只,购自中牟县某养兔场,各种隐孢子虫、球虫、猪等孢球虫均为本实验室分离保存。1.1.3试剂及器材:1.1.3.1抗体提纯试剂及器材同实验二1.1.3.2标记试剂及器材(1)0.1M NaIO:称取241mg高碘酸钠(上海浦东化学试剂厂 20010523)溶于蒸馏水10mL中。(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc(天津科密欧化学试剂开发中心 20031107) (1.361克50mL) 3.7mL0.2M HAc (0.601mL50mL) 6.3mL加蒸馏水至2,000mL。(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:NaCO 0.32
5、克NaHCO 0.586克加蒸馏水至50mL再用蒸馏水作20倍稀释,即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH(FLUKA进口分装 20040726)溶液(4mgmL):临用时称取NaBH4mg溶于1mL蒸馏水中。(5)0.01M PH7.4 PBS。(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。(7)萘氏试剂(8)纯化的兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体。(9)HRP(上海雪满生物科技有限公司20041228, RZ3.0,酶活力:300u以上/mg)。(11) 搅拌器,分光光度计,离心机。(12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。1.1.3.2 ELISA试剂及器材见实验二1
6、.2方法1.2.1兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体的制备隐孢子虫抗原,采自西郊某奶牛场阳性牛,经蔗糖浓度梯度离心纯化后,用PBS调整卵囊浓度为2108个/mL左右。将上述提纯卵囊置超声波细胞粉碎仪上以80%的功率粉碎6分钟,然后将粉碎物置液氮和和37冻融5-6次,经3500rmin-1离心10分钟,测定上清中性液蛋白含量,可溶性抗原用于抗体检测,使用部分可溶性抗原和全部沉淀(非可溶性抗原)制备免疫原。将上述抗原的一部分(冻融的上清和破碎的卵囊碎片)混合物加2倍量的弗氏完全佐剂乳化制成油苗。另一部分不加油佐剂,作为水苗。免疫,首先用油苗免疫,每只兔子免疫1mL,背部皮下多点注射和腹腔注射相结合。免疫兔用
7、全价饲料饲养于清洁动物房内。免疫兔从颈静脉放血,血液置于灭菌平皿中,于37自然析出血清。1.2.2兔抗牛安氏隐孢子虫IGg抗体的提纯 参照实验二的方法提纯和测定兔抗体的浓度。1.2.3 IgG抗体的标记参照董邦全54的方法略加改进,标记步骤如下:(1)称取5mgHRP溶解于1mL双蒸水中。(2)于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO溶液,室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4过夜。(4)加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化的HRP的PH升高到9.09.5,然后立即加入含适量IgG的1mL 0.01M碳酸盐缓冲液
8、中,室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1mL新配的4mgmL NaBH液,混匀,再置42小时。(6)将上述液装入透析袋中,对0.01M PH7.4 PBS透析,4过夜。(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置41小时。(8)3000rmin-1离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量0.01M PH7.4的PBS中。(9)将上述溶液装入透析袋中,对0.01M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),4500rmin-1离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。结果判定:IgG量(mgmL)(OD280nm-OD403nm0.
9、3)0.621.2.4酶标抗体工作浓度的选择55 先将抗原用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10gmL左右,酶标板内,每孔100l,4过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤3次。用1%的BSA封闭(37孵育1小时)洗涤3次。酶标记抗体用0.01M的PBS液依次稀释成1100,1200,1400,1800,11600(根据据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度4-8孔,每孔100ul,37孵育1小时后洗涤。然后加底物溶液,每孔100ul,室温1015分钟。以2M HSO 50ul终止反应。1.2.5检测样品的制备标准阳性粪样,采自粪检阳性牛场;标准阴性粪样,为粪便集虫后,显微镜下检验看不到卵
10、囊,即为阴性的牛粪;交叉反应粪便,仅有鸡球虫的鸡粪样、猪等孢球虫的猪粪样、有牛小球隐孢子虫感染的牛粪、有鸵鸟隐孢子虫的鸵鸟粪样等。将这些粪样用0.01M的PBS稀释后过滤,参照粗提卵囊的方法处理这些样品。标准阳性卵囊样品在计数后,稀释成不同的浓度,进行冻融、破碎、或乙醚除脂等处理后用于实验。1.2.6.双抗夹心法工作程序用0.05M PH9.6包被缓冲液适当稀释兔抗/单抗 (),于微量酶标板每孔加100,置4过夜后,用PBS-T洗涤液洗3次。用1%的BSA封闭(37孵育1小时),洗涤3次甩干。每孔加待测样品100l,同时设阴性和试剂空白对照,放置37反应1,用0.0MPBS-T洗液洗涤3次。每
11、孔加适当稀释的酶标抗体1001置37反应1,用洗涤液洗涤5次。每孔加底物溶液100,室温暗处放置1015显色,每孔加终止反应液50。然后在酶标测定仪上测定450处的值。以样品孔的值()与阴性对照孔的值()之比大于2(即/2.1)时定为阳性。1.2.7双抗夹心法工作浓度的确定通过点阵分析法确定用于检测一定浓度抗原所需抗体()和酶标抗体的工作浓度。将兔抗体/单抗()浓度分别稀释成不同浓度,虫卵浓度分别为107、106、105、104、103和102个/,酶标抗体也配成不同的稀释度。在工作浓度选择中,以/2.1时,兔抗体/单抗()浓度最低、酶标抗体稀释度最高为最适条件。1.2.8特异性反应试验对1份
12、猪等孢球虫卵囊而无隐孢子虫卵囊的猪粪样,有小球隐孢子虫卵囊而无球虫的牛粪,有鸡球虫粪样、有鸵鸟隐孢子虫的鸵鸟粪样按前述方法处理后进行ELISA检测。 1.2.9 敏感性试验对若干含隐孢子虫的牛粪样分别进行抗酸染色和ELISA检测,对检测结果进行比较。1.2.10重复性试验 对相同样品分次进行检测,比较检测结果的一致与否。 2.结果与分析2.1兔抗牛源安氏隐孢子虫抗体的制备与标记抗原制备两种,第一种制成油苗后含可溶性抗原1.2mg/mL,颗粒性抗原6.5107个/mL。第二种抗原未加免疫油佐剂,颗粒性抗原1108个/mL,可溶性抗原1.24mg/mL。实验兔经表5所示的6次免疫后,合计共免全卵囊
13、(超声破碎混合物)数为3.5108个/只。第6次免疫后15天时测定血清抗体琼扩效价为1:8,此时采血制备血清,按实验二中辛酸硫酸铵法提纯IgG,测定其蛋白含量为18.49mg/mL。表5.实验兔的免疫途径及免疫剂量Tab5. The vaccine dosage, usage of immunized rabbit免疫次数immune-time免疫途径usage剂量(mL/只)dosage间隔时间(天)interval抗原量(个/mL) antigen quantities1皮下多点注射1(油乳苗)146.51072皮下多点注射1(油乳苗)146.51073皮下多点注射1(油乳苗)146.51
14、074腹部皮下/腹腔注射0.5(水乳苗)1051075腹部皮下/腹腔注射0.5(水乳苗)751076腹部皮下/腹腔注射0.5(水乳苗)5107将上述提纯的抗体分两次标记HRP,测定第二次的酶结合物中HRP浓度为1.4 mg/mL,IgG浓度为1.755 mg/mL,酶/抗体摩尔比为1.18。均在合适的浓度范围内。2. 2酶标记抗体的工作浓度的选择 将新制备的抗原(新)稀释10g/mL、5g/mL分别包被酶标板,以前制备的抗原(原)按1:100包被板子,4过夜后用PBS-T洗涤三次,每次2分钟,加入不同稀释度的酶标兔抗隐孢子虫抗体,置37作用1小时,加入底物溶液后置室温显色1015分钟,终止反应
15、,酶标仪读数。结果见表6,表7。表6.酶标1号抗体的工作浓度选择.Tab6.The selection of antibodyseemLy dilution抗原的浓度 不同稀释倍数的酶标抗体OD值Antigen dilution HRP-antibody OD value of the different dilution multiple 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400新5g/mL0.644 0.604 0.575 0.495 0.337 0.260 0.188 0.1
16、31 0.095 0.074 0.050 0.621 0.576 0.536 0.444 0.331 0.257 0.183 0.122 0.092 0.072 0.050新10g/mL0.75 0.562 0.477 0.376 0.305 0.199 0.132 0.108 0.087 0.074 0.057 0.75 0.526 0.464 0 .334 0.265 0.184 0.124 0.097 0.075 0.061 0.051原1:100 1.033 0.970 0.823 0.840 0.734 0.594 0.433 0.376 0.181 0.159 0.101 1.11
17、0 1.063 0.838 0.599 0.628 0.625 0.346 0.424 0.172 0.162 0.134 1.066 0.888 0.852 0.669 0.655 0.487 0.052 0.046 0.047 0.046 0.035 表7.酶标2号抗体的工作浓度选择Tab7.The selection of antibodyseemLy dilution抗原的浓度 不同稀释倍数的酶标抗体OD值Antigen dilution HRP-antibody OD value of the different dilution multiple 1:100 1:200 1:400
18、 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:51200 1:102400新5g/mL. 0.831 0.711 0.702 0.635 0.607 0.579 0.565 0.437 0.311 0.218 0.057 0.3740.052 0.741 0.672 0.749 0.639 0.607 0.533 0.460 0.315 0.219 0.064 0.548新10g/mL 0.724 0.664 0.679 0.639 0.579 0.535 0.437 0.334 0.248 0.149 0.056 0.606 0.057 0.69
19、2 0.667 0.619 0.594 0.515 0.444 0.341 0.228 0.148 0.057 0.461原1:100 1.244 0.840 0.889 0.919 0.744 0.630 0.618 0.561 0.502 0.433 0.309 0.903(+) 1.290 1.081 1.102 0.953 0.878 0.776 0.686 0.619 0.555 0.465 0.344 1.345(+) 1.140 1.164 1.177 0.998 0.877 0.767 0.710 0.643 0.552 0.468 0.338 1.434(+)由上述两表可见:
20、酶标1号抗体的工作浓度为:1:200400,2号抗体的工作浓度为1:400800为合适的工作浓度。将两标记物各加50%甘油,分别混匀后分装,放-20保存备用。2.3不同处理方法对样品检测结果的影响将待检样品分别做以下处理:1.粗提后不加处理,2.经超声波破碎后反复冻融处理,3.经乙醚除脂后再破碎冻融。分别将以上方法处理的样品根据卵囊计数结果分别配成不同稀释度的检样进行检测,结果见表8。在合适的条件下(抗体包被浓度10g/mL,二抗工作浓度为1:800时),样品经超声波破碎后加液氮-37反复冻融后再检测,效果最好;乙醚处理后再同上处理,结果OD值稍低;未经处理的隐孢子虫卵囊液比同滴度的处理样品O
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