westernblot参考资料.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流westernblot参考资料.精品文档.Western blot基础知识一、 原理与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达
2、的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、分类根据凝胶电泳的类型,WB可分为:*还原(变性)WB:最常用的一类,使用SDS-PAGE电泳。主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等*非还原(非变性)WB:主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。一般不使用SDS、DTT等变性剂。western显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,
3、操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。 三、主要试剂1、29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N,N-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29gN,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水至100ml终体积储于棕色瓶,4避光保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS0.1g去离子水1ml室温保存。3、 分离胶缓冲液1.5mmol/LTris-HCL(
4、pH8.8)Tris base18.15g1mol/LHCL48mlSW至100ml终体积过滤后4保存。4、 浓缩胶缓冲液0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8)Tris base6.05gSW40ml用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,而不用Tris.CL。5、 TEMED原溶液N,N,NN四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时,聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml,临用前配制
5、.6、 SDS-PAGE加样缓冲液pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml, 甘油6.4ml10%SDS12.8ml巯基乙醇3.2ml0.05%溴酚蓝1.6mlH2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100g。7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris30.3g甘氨酸188gSDS10gSW至1000ml得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。8、 转移缓冲液甘氨酸2.9gTris碱5.8gSDS0.37g甲醇200mlSW至总量1L9、 丽春红染液储存液
6、丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30gSW至100ml加水用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。10、 脱脂奶粉5%(w/v)。11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒,戴手套操作),溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LnaCl。13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 过氧化物酶标记的第二抗体。15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺,75mg/ml)。16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺,50mg/ml)。17、 1
7、00mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、 100mmol/L NaCl。19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA。四、实验流程第1步:组织或细胞蛋白提取 蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏,因此,根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的!收集106细胞,加入150l SDS裂解液,冰上超声5次,定量。第2步:电泳、转膜电泳和转膜是保证成功进行WB后续检测的前提条件。根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率最高。在电
8、泳和转移过程中,正确使用蛋白质分子量Marker,是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证!SDS-PSGE电泳:1.准备各溶液。 小烧杯两个,5ml枪头6个,吸水纸,罐胶电泳设备。2.准备罐胶槽。 将玻璃板擦干净,放入短架子内,薄板靠门,两玻璃板及架子的底缘须在同一平面(否则漏胶);将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜;将短架子装在长架子上(短架子底缘须与垫片紧密接触,否则漏胶)。3.准备配胶。 将各溶液(ddH2O,单体,Tris-HCl,SDS,TEMED,APS)依次摆好,5ml枪头插于长罐胶槽,调好取TEMED、APS的枪。4.配分离胶。 在一小烧杯上装半杯ddH2O
9、;另一小烧杯依次加上述各液(加TEMED、APS时要迅速),快速摇匀。 注:胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。5.罐胶。 从玻璃板中间注入胶液,注胶速度均匀,不要产生气泡。罐胶后用ddH2O压胶。6.等待时: 将Tris-HCl换成pH6.8。换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。调好各移液器。7.30分钟后。 倒掉压胶水,用滤纸吸干残留水,注意不要触及胶面。8.配集成胶。 参见步骤4。9.罐胶。 参见步骤5,灌满为止,不要有气泡。10.插梳。 梳柱下面不要有气泡。11.等待时。 A:配电泳缓冲液。B:将样本煮沸5分钟。C:水中冷却,短暂离心后依加样序排放好。D:等胶近凝时,将玻璃板装在电泳架子上
10、,罐内槽液于槽中,检查是否密封。E:将上槽架子按于槽中。12.30分钟后。 罐上槽液超过短玻璃板,拔梳(注意力道适中,不能太快)。放置上样架子。13.上样30l。 枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出,使样品液从胶面往上涨,枪头随液面上涨而上提。可以不把最后一滴样品打出,但是每个样品都须同样处理。14.加外槽液。15.电泳。转膜:1.准备。 分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具,在电泳槽中倒好转膜液2.揭胶。 电泳结束后,将电泳槽移至水池中,倒掉电泳液,将内槽提起放在水池边,取出两边玻璃板。用纯水冲干净玻璃板,小心揭开短板,去掉集成胶,小心将胶转入转膜液在中。3.转膜。 将夹子打开,黑色
11、在底,依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵,关好夹子(均在液面下进行,注意气泡)快速放入架子中。在电泳槽中放冰袋。4.电泳。蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜(湿式转膜)1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后,小心取出带有凝胶的玻板,用割胶刀沿下边缘小心撬开短板,按样品的多少切下合适大小的凝胶。浸泡在转膜缓冲液中5分钟左右,以平衡离子强度。视情况决定是否切角标记。 2)电用结束前,应泡好3M滤纸2-6张均可(普通滤纸也可)和1张硝酸纤维素滤膜。 3)戴上手套按如下顺序安装转移装置: a.平放底部电极(阴极),放一张海绵垫片。 b.在海绵垫片上放置1-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸,逐张
12、叠放,对齐,然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡,必要时可滴加转膜液润湿。 c.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。排除所有气泡。 d.把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上,在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。 e. 把最后1-3张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方,同样须确保不留气泡。其实,用玻棒给点压力很容易排除气泡。 f.放上另一张或几张海绵垫片,盖上阳极板,夹紧。保证对凝胶有一定的压力。 4)连接电源。电转过程中,尽量给个低温环境,我放在冰水里转膜,也用内置的冰盒。 5)断开电源,拆卸转移装置,逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中,进行染色,可检查蛋白质转移是否完全。
13、要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色3-10分钟,然后蒸馏水冲洗 6)切去滤膜的左下角,以标记,如有预染MARKER也可不标。 7)杂交与显色: 封闭 一抗孵育:分别与相应的抗体及内参照抗体孵育 漂洗:室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上,每次各10min。 与二抗孵育:与辣根过化物酶标记的二抗孵育 漂洗:室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗4次以上,每次各10min。 ECL显像 显影定影完毕 第3步:加入一抗孵育一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键:选择一抗有以下几个注意点:1、 选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证)2、 选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证
14、)3、 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体一抗的保存和使用:1、根据说明书的要求条件进行抗体的保存;一般需要将抗体分装后放入-20度保存,绝对避免反复冻融。2、抗体的工作液最好现配现用,在4度保存最好不要超过2周3、由于实验室条件和检测方法等的差异,说明书推荐的稀释比例只作参考,需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测,然后选择信噪比最好的抗体浓度进行实验。1.转膜等待时 准备封闭液(即Non-fat milk 5% in TBST)。2.转膜完毕后, 将膜放入封闭液中,轻摇孵育1小时。3.孵一抗。 将封闭好的膜在转移到一抗盒子中,室温孵育两小时或4过夜,4.洗涤 将孵育好
15、一抗的膜在TBST洗涤3次,每次5分钟。5.孵二抗。 将洗好的膜放在二抗中室温孵育两小时。6.洗涤。 将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次,每次5分钟。7.ECL化学发光和曝光显影。实验常见的问题指南1. 参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好?解答:抗体技术实验指南和Antibodies(a laboratory manual, wrote by Ed Harlow ,david lane)两本书不错。2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot,提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120g,换了
16、个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程, 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。C. 细胞水平要做Western Blot,多少细胞提的蛋白够Western Blot? 解答:一般地5* 106就足够了。D. 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗,这样对Western Blot有无影响? 解答:能,没有问题,我们做过。E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗?
17、解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么?解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G. 我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加510甲醇。H. 想分离的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Wes
18、tern Blot吗?解答:260kd的蛋白不好做, 分离胶用6, Stacking Gel 3.5。I. 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的 comb。J. 蛋白变性后可以存放多久?解答:80,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。K. 我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分离胶应当采用7.5%,但我所查资料却要求
19、分离胶和浓缩胶均采用11的配方,不知为何?解答:上述您提到的两种凝胶均可以使用,因为105的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意条带位置。L. 接下来我准备采用DAB显色技术,二抗是生物素化的多克隆抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗? 解答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用代替应该好一点M.一般一次上样的蛋白总量是多少,跟目的蛋白的表达量有关系吗?解答:Western Blot一般上样30100微克不等,结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系,也
20、与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了,当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。N. 做组织样品的western的时候,处理样品有什么诀窍吗?还有,您用过大牛血清做封闭剂吗?浓度如何?效果是不是比BSA好一点?解答:必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入和蛋白酶抑
21、制剂cocktail),封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体,使用也是不错的选择。O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD,在做western要注意什么呢?解答:做200kd蛋白的Western Blot时要注意,分离胶最好选择7%的;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析)。P. 有什么方法可以提高上样量?解答:可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量。Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白,膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机,有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法,42kd的蛋白分子量算不算大?解答:如是
22、需要提取膜蛋白,(而不是只需要提取膜蛋白),可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白,用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大,也不算小,所以,可以按照一般的转移方法实施。R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求?解答:上样量要根据实验的要求来定, 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等, 如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了, 但是不要超过0.3g/mm2。S. 一抗,二抗的比例是否重要?解答:比较重要,调整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特异的本底。3. 抗体T. 做细胞信号传导,要
23、做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?解答:对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好,所以没做预试,怕费时间,用什么样的稀释度比较好呢?我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜,一抗孵育也是过夜的,若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。解答:不同抗体,即使是同一公司的抗体,其最佳的抗体稀释度也是不一样的,需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧,转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦,何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间,还要看你的目的蛋白分子量的大小;转膜的设备,是半干式,还是湿式。一抗当然可以过
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