生化论文.doc
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1、【精品文档】如有侵权,请联系网站删除,仅供学习与交流生化论文.精品文档.含锰酶模型化合物催化机理的研究摘要含金属锰酶因其独特的生物功能吸引了越来越多的研究兴趣。基于含锰酶的活性中心结构,通过设计并合成与酶活性中心结构类似的金属配合物,模拟酶的催化反应,借此来研究其催化机理,成为研究这些含锰酶的有效方法之一。本文所参照的论文旨在通过对模型化合物的研究,特别是研究小分子对模型化合物的催化活性的影响,深入了解含锰酶的催化机理。 基于锰过氧化氢酶及锰超氧化物歧化酶的活性中心,合成了两类希夫碱锰配合物:含Salen类配体的锰配合物以及含HbaP类配体的锰配合物(salen为N,N一二(亚水杨基)一1,2
2、一乙二胺,HbaP为N一(2一亚水杨基)氨基毗睫)。其中配合物 Mn(Bthap)Im、Mn(Meobap)Im、以及还原的Mn伪aP)Py为新配合物。应用x一射线单晶衍射、紫外光谱、电喷雾质谱、元素分析和电化学等方法对配合物的结构进行了表征。 对上述所合成的配合物的锰过氧化氢酶活性及其机理进行了研究。详细分析了配体中苯环上取代基、溶液的酸碱性、小分子有机碱,如咪哇,毗睫等轴向配位对活性的影响。研究发现苯环上给电子基团可以提高配合物的过氧化氢酶活性,而吸电子基团却没有明显的影响。溶液的pH值也可以明显调控salen类锰配合物的催化活性。通过结合了小分子碱的配合物与原配合物的比较,我们认为有机小
3、分子碱增强配合物催化活性的机理为:当等当量的小分子碱存在时,它首先与配合物的金属离子配位,形成了一个活性较高的中间体;当过量的碱存在时,除了与金属离子配位外,它们还起到了分子内碱的作用,协助底物质子化作用。通过对模拟配合物的结构和催化反应的研究促进了我们对锰过氧化氢酶及锰超氧化物歧化酶的催化反应机理的了解,而且有望在不久的将来将具有催化活性的配合物取代相应的酶运用于实际应用中。关键词:锰一salen;过氧化氢酶;超氧化物歧化酶;模型化合物:分子内碱1.1锰过氧化氢酶(Manganese catalase, MnCAT)1.1.1MnCAT的结构从细菌中分离出的锰过氧化氢酶主要有三种,分别来自细
4、菌Lactobaciliusplant(LP)、ThermoleoPhilumalbum(Ta)和Thermusthermophilus(Tt)。虽然三种酶的来源各不相同,但研究发现它们的活性中心都含有双核锰的结构。目前对Tt和LP的研究最为详细,它们包含六个互为等价的亚基,每个亚基分子量约为35kDa。高分辨的锰过氧化氢酶晶体结构的获得对我们了解MnCAT的结构起了巨大的推动作用。如图1.1所示,来自Tt的锰过氧化氢酶的X射线结构研究表明,每个亚基中,4个反平行的a一螺旋束是MnCAT二级、三级折叠的主要组分(其中包括2530个氨基酸),与一些双核铁酶的结构非常相似。两个锰原子之间通过谷氨酸
5、残基(Glu70)及外源的氧原子(来自水分子)进行桥连。其中的一个锰离子分别与谷氨酸残基(Glu36,Glu70)中的氧原子,组氨酸残基(His73)中的氮原子和水分子中的氧原子发生配位,另一个锰原子分别与谷氨酸残基(Gfu155,Gfu70)中的氧原子,组氨酸残基(His188)中的氮原子和水分子中的氧原子发生配位。1.1.2MnCAT的催化机理作为一种氧化还原酶,了解锰离子的价态对锰过氧化氢酶催化机理的研究和设计功能模拟物都具有重要意义。通常认为在锰过氧化氢酶在催化过氧化氢分解的过程中至少存在四种氧化态,即MnMn,MnMn,MnMn,MnMn,目前大多数实验证明MnMn和MnMn对分解过
6、氧化氢具有高催化活性,且催化循环在MnMn和MnMn之间进行。MnCAT在催化H2O2分解的过程中,先从还原态MnMn转化为氧化态MnMn,最后再被还原为MnMn。通过MnCAT与H2O2之间的氧化还原作用,使锰离子在不同氧化态间相互转化从而促使催化歧化反应的进行。1994年,Vincent.L等人基于对MnCAT模型化合物的研究提出了关于MnCAT催化过氧化氢歧化反应的P1n9pong机理。之后,Dismukes等人通过对MncAT及其模型物的研究,根据大量实验证据,提出MnCAT催化过氧化氢歧化反应是一个由五步构成的循环过程,并指出小分子配体,如水分子在催化过程中起到了重要作用。反应过程中
7、锰模型化合物在闭合的状态时(六配位结构)不具备催化活性。当锰模型化合物在打开的状态时(A,六配位转变成五配位)具有催化活性。第一步反应AB十分重要,底物过氧化氢通过取代小分子H2O而直接与一个Mn原子端相连。Dismukes在其1996年提出的机理中指出,该过程在进行时,活性中心附近的某一氨基酸残基充当质子受体,促进过氧化氢的质子化,以便于亲核取代反应的进行。不过,在图中所示的机理中的AB反应中,底物H2O2与羟桥OH似乎直接发生了质子交换,质子受体的作用反而显得不怎么明显。接着过氧基团替代了桥连的水分子,形成配合物C。接着配合物C、D的过程,是Mn离子由还原态()转化为氧化态()(两个电子从
8、锰离子转移到氧原子上),MnA上的过氧基团转变成羟基,桥连的过氧基团转变成氧原子,同时释放出一分子水。DE,另一分子底物H2O2键合在配合物D的MnA()上,脱去一个水分子,形成配合物E。分子内两个电子从过氧化物转移到两个三价锰离子上,使后者还原为二价形成还原态水合配合物A,同时质子转移到羟基上,生成O2。由于没有得到中间体配合物的结构,反应的具体机理还有待于进一步的研究证实。此外,Dismukes等认为MnCAT的模型化合物的氧化还原电势不是影响它们催化速率的决定性因素。1.2锰超氧化物歧化酶(Manganesesuperoxidedismutase,MnsoD)1.2.1MnSOD的结构特
9、征迄今发现的MnSOD大约有30多种,已完成氨基酸序列全分析的MnSOD有近10种。不同来源的MnSOD具有不同的氨基酸组成和顺序,一般多含2个或4个亚基即二聚体和四聚体,也有少量为三聚体形式。通常每个亚基含有一个锰离子,其分子量因而有40kDa、60kDa和80kDa三个范围。从提取自T.thOPhilus中的MnSOD中获得的x一射线结构数据表明,MnSOD由两个对称的亚基组成,在每个亚基中,由203个氨基酸残基组成的多肤链形成一个“全a式和一个“p/a”式结构域;这两个结构域由一个锰离子连接一起,构成Mnsoo的活性中心。每个三价锰离子与His28、His83、Asp165、His169
10、和一个水分子或轻基配位,后三个配位基团位于平面位置,His28的咪哇基团则占据着另一个轴向位置,因此呈现出如图所示的五配位的三角双锥几何构型。1.2.2MnSOD的催化机理Liao等的研究表明Mn一SOD的催化作用是通过Mn(II)和Mn(m)间交替得失电子来实现的,其反应步骤如图。O2-+Mn3+O2+Mn2+2H+O2+Mn2+H2O2+Mn3+2O2-+2H+H2O2+O2Mn()被O2-原为Mn(II),释放出分子氧。随后Mn()再被另一个分子O2-氧化为三价并生成H2O2。一般认为在催化过程中,O2-首先与金属离子配位,形成过渡中间体。这与Cu-ZnSOD酶的催化机理相似,催化过程中
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