WST 632—2018巴贝虫检测血涂片镜检法.pdf
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1、ICS 11.020 C 61WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS/T 6322018巴贝虫检测 血涂片镜检法Detection of Babesia spp.Blood smear microscopy examination method2018 - 09 - 26 发布2019 - 04 - 01 实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发 布WS/T 6322018I前 言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由国家卫生标准委员会寄生虫病标准专业委员会提出。 本标准起草单位:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、第二军医大学、中国农业科学院上
2、 海兽医研究所。 本标准起草人:张仪、周晓农、刘琴、陈韶红、朱淮民、周金林。WS/T 63220181巴贝虫检测血涂片镜检法1范围本标准规定了检测巴贝虫的血涂片镜检法。 本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对巴贝虫的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 WS/T 569 疟原虫检测 血涂片镜检法 WS/T 564 巴贝虫病诊断3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1巴贝虫 Babesia spp.一类寄生于人和脊椎动物红细胞内的原虫,
3、可引起巴贝虫病(Babesiosis)。感染人体的巴贝虫有 田鼠巴贝虫(Babesia microti)、分歧巴贝虫(B. divergens)、邓肯巴贝虫(B. duncani)和猎户巴贝虫(B. venatorum)等。3.2血涂片 blood smears将血液涂制于载玻片上制成的涂片, 分为厚血膜涂片和薄血膜涂片。4仪器和器材4.1光学显微镜(100油镜、10目镜)4.2血涂片染色架4.3血涂片干燥架4.4玻片盒4.5染色盘和染色缸WS/T 632201824.6 计数器5试剂和材料5.1吉氏染色原液(Giemsa)5.2pH7.2 磷酸盐缓冲液(PBS)5.3标准级载玻片(洁净载玻片
4、,或表面带正电荷的粘附玻片)5.4甲醇 (分析纯)5.5香柏油或专用浸油 (折射率1.5)5.6二甲苯 (分析纯)5.7 甘油6检测步骤6.1血涂片的制作6.1.1采血部位及取血方法末梢(无名指指尖或耳垂)取血。用75酒精棉球消毒取血部位,待酒精挥发后,用拇指和食指紧 捏耳垂上方或无名指指尖,另一只手手持一次性采血针迅速刺入皮肤,轻轻挤压出血。婴儿可从拇趾或 足跟扎刺取血。6.1.2厚血膜制作取 1张已消毒的载玻片(或粘附玻片)作推片,用推片的一角,取 4L5 L的血量,使血与另 1 张平置的载玻片 (或粘附玻片) 中央偏右的位置接触, 由里向外旋转, 画 2 圈4 圈, 涂成直径 0.8 c
5、m 1 cm大小圆形厚血膜(见附录A)。6.1.3薄血膜制作干棉球抹净推片下角的血渍,用同一张推片中部取约 1 L 1.5L的血量。将血置于离厚血膜左边 缘约 0.3 cm 的位置,推片的边缘紧贴载玻片,上下轻轻移动,使血沿推片的边缘散开至 2cm宽,使两 张玻片保持 2535角,从右向左迅速推动推片向前,推成舌状薄血膜(见附录A)。6.1.4编号血涂片制好后水平放置, 充分干燥后, 在玻片一侧毛玻璃上或在靠近厚血膜一端边上标注编号和日 期。6.2固定与溶血6.2.1薄血膜固定将薄血膜一端朝下呈 45角,用一次性吸管吸取甲醇溶液,均匀轻抹于薄血膜表面,避免碰触厚血 膜。WS/T 6322018
6、36.2.2厚血膜溶血在干燥的厚血膜上滴加蒸馏水数滴, 完全覆盖血膜, 溶血数分钟, 待血膜呈浅灰色, 倾去溶血血液。6.3吉氏染色6.3.1吉氏染液的配制常用的吉氏染液工作液包括 2%、3%、10% 三种浓度,分别由吉氏染液原液和pH 7.2磷酸盐缓冲 液(PBS)按比例配制,也可购买商品化吉氏染液原液加实验用纯水按比例配制(见附录 B)。6.3.2 吉氏染色染色方法见附录B6.4显微镜检查在染色后的血涂片上加 1滴香柏油或专用浸油,用 100(倍)油镜、10(倍)目镜的光学显微 镜检查。观察血片路线顺序为薄血膜从尾部舌尖部分开始,厚血膜从上端或下端开始(见附录A)。6.5结果判定6.5.1
7、巴贝虫检测阳性血膜中发现巴贝虫判定为阳性(参见附录C)。6.5.2巴贝虫染虫率计数6.5.2.1 薄血膜的巴贝虫染虫率计数法显微镜下检查薄血膜,计数每个视野中的染虫红细胞和红细胞总数 2 000 个以上。用下式计算巴 贝虫染虫率。巴贝虫染虫率 红细胞总数染虫红细胞 100 。6.5.2.2 厚血膜的巴贝虫染虫率计数法若染虫率低于 0.1时,显微镜下检查整张厚血膜片,计数整张厚血膜片的巴贝虫虫体数和红细胞 总数。用下式计算巴贝虫染虫率。巴贝虫染虫率 100 (红细胞数男性按 500万个/L血、女性按 450万 个/L血计算)。WS/T 63220184A附录 A (规范性附录) 操作示意图图 A
8、.1 厚薄血膜血涂片的制作过程示意图WS/T 63220185图 A.2厚薄血膜血涂片的制作示意图图 A.3 厚薄血膜血涂片的读片示意图AWS/T 63220186BB附录 B (规范性附录) 试剂配制与血涂片染色、保存方法B.1吉氏染色原液配制将 5.0 g 吉氏粉置于研钵中,加入少量甘油充分研磨,然后边加边磨,至 250 mL 甘油加完为止, 倒入 500 mL 有塞深色玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇,洗掉剩余部分,倒入瓶内,再次加甲醇,洗 后再倒入瓶中,至 250 mL 甲醇洗净研钵中甘油为止。置室温内,避免阳光直射。塞紧瓶塞,避免蒸发 和高湿造成的氧化。每天用力摇动溶液 5 min,3
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