水产品中氯霉素的快速检测胶体金免疫层析法.doc
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1、1附件 5水产品中氯霉素的快速检测 胶体金免疫层析法(征求意见稿)1 范围本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。2 原理本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取,固相萃 取小柱净化,浓缩复溶后,氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合,抑制了抗体和微孔 膜检测线(T 线)上抗原的结合,从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色 深浅比较,对样品中氯霉素含量进行定性判定。3 试剂和材料除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 正己烷。
2、 3.1.2 丙酮。 3.1.3 乙酸乙酯。 3.1.4 乙腈 3.1.5 磷酸二氢钠,NaH2PO42H2O。 3.1.6 磷酸氢二钠,Na2HPO412H2O。 3.1.7 氯化钠 3.1.8 复溶液:称取 0.12g 磷酸二氢钠 (3.1.5)置于 100ml 容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,制 成溶液 A;称取磷酸氢二钠 7.16g (3.1.6)置于 100ml 容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,制成溶 液 B。取溶液 A 2.8ml、溶液 B 7.2ml、氯化钠(3.1.7)0.85g,用水溶解并稀释至 100ml,得磷酸 盐缓冲液。 3.1.9 丙酮-正己烷(1+9):丙酮(3.1
3、.2) 、正己烷(3.1.1)按体积比 1:9 混匀。 3.1.10 丙酮-正己烷(6+4):丙酮(3.1.2) 、正己烷(3.1.1)按体积比 6:4 混匀。 3.2 标准物质 氯霉素参考物质的中文名称、英文名称、CAS 登录号、分之式、相对分子质量见表 1,纯 度98.6%表 1 氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS 登录号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称CAS 登录号分子式相对分子量氯霉素chloramphenicol56-75-7C11H12CL2N2O5323.13注:或等同可溯源物质。23.3 标准溶液配制 3.3.1 氯霉素标准储备液(1 mg/mL):精密称取氯霉素标
4、准品(3.2)适量,置于 10 mL 容量 瓶中,用乙腈(3.1.4)溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为 1 mg/mL 的氯霉素标准储备液。4避光保存,有效期 6 个月。 3.3.2 氯霉素标准中间液 A(10g/mL):精密量取氯霉素标准储备液(1 mg/mL) (3.3.1)0.1 mL,置于 10 mL 容量瓶中,用乙腈(3.1.4)稀释至刻度,摇匀,制成 10 g/mL 的氯霉素标准 中间液 A。4避光保存,有效期 3 个月。 3.3.3 氯霉素标准工作液(0.01g/mL):精密移取氯霉素标准中间液 A(10g/mL) (3.3.2) 0.01 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中
5、,用乙腈稀释至刻度,摇匀,制成浓度为 0.01 g/mL 的氯霉 素标准工作液。临用新配。 3.4 材料 3.4.1 固相萃取小柱:Cleanert Silica,200mg/6ml。LOT:0170198 3.4.2 免疫胶体金试剂盒(在 230、干燥阴凉条件下保存,在产品有效期内使用) 。 3.4.2.1 金标微孔。 3.4.2.2 试纸条或检测卡。4 仪器和设备4.1 移液器:200 L、1 mL 和 5 mL。 4.2 涡旋混合器。 4.3 离心机:转速4000 r/min。 4.4 电子天平:感量为 0.01 g。 4.5 振荡器。 4.6 样品浓缩仪:如有需要。 4.7 环境条件:
6、温度:1525,相对湿度:60%。5 分析步骤5.1 试样制备 取具有代表性样品约 500 g,充分粉碎混匀,均分成两份,分别装入洁净容器作为试样和留 样,密封,标记,于常温保存。 5.2 试样提取和净化 准确称取试样 6g(精确至 0.01g)置于 50mL 具塞离心管中,依次加入 4mL 水和 8mL 乙酸 乙酯(3.1.3) ,涡旋提取 5min,以 4000r/min 离心 5min。转移全部乙酸乙酯层于 50mL 具塞离 心管中,加入正己烷 25ml,氯化钠 1g 涡旋混匀,4000r/min 离心 1min,上清液待净化。5ml 丙酮-正己烷(1+9) (3.1.9)淋洗 LC-S
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