细菌定量杀灭试验.docx
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1、细菌定量杀灭试验2.1.1.7.1 目 的 在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上细菌繁殖体和细菌芽孢所需剂量,以验证实用消毒剂量。2.1.1.7.2 试验器材(1)按 2.1.1.2 所示方法制备的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽孢悬液或菌片。此外,根据消毒剂特定用途或试验特殊需要,准备其他菌种的悬液或菌片。(2)消毒剂溶液除有特殊规定者外,应使用无菌硬水配制。消毒剂溶液浓度应以所含有效成份为准。例如,含氯消毒剂以所含有效氯浓度为准,碘伏以所含有效碘为准,过氧乙酸以所含过氧乙酸量为准,复方消毒剂浓度以主要杀菌有效成分含量为准。各组消毒剂溶液有效成份浓度的计算,应以试
2、验菌与消毒剂的混合液中有效成份的最终浓度为准。(3)去除残留消毒剂的中和剂或设备 (经鉴定试验证实合格的中和剂或有关器材)。(4)消毒剂稀释用硬水:见附录 A。(5)有机干扰物质。悬液试验用 3%BSA 溶液,载体试验直接用TSB(见附录 A)。(6)TSA 培养基:见附录 A。(7)含中和剂的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(中和剂 TSB),中和剂经鉴定合格。(8)刻度吸管 (1.0ml、5.0ml)。(9)恒温水浴箱。(10)喷雾器(用于喷雾消毒试验)。(11)电动混合器。(12)秒表。2.1.1.7.3 试验分组试验中应分以下各组:(1)试验组。按测试目的有两种选择。第一种适用于消毒产品鉴定。根
3、据本规范中表 1-1 和使用说明书,选定试验菌和一个消毒剂浓度(即产品使用说明书中指定的最低浓度)以及 3 个作用时间(说明书指定最短作用时间,指定最短作用时间的 0.5 倍,指定最低作用时间的 1.5 倍。如说明书指定最短作用时间为 20min,则应进行 10min、20min、30min 三个时间)进行试验。第二种适用于消毒产品监督机构日常监测。根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力,选定一株抗力较强的菌和一个消毒剂浓度(即产品使用说明书中指定的最低浓度)以及一个作用时间(说明书指定最短作用时间)进行试验。(2)阳性对照组。根据各种试验的规定,用稀释液代替消毒剂溶液,按上述同样的步骤进行试验
4、。所得结果代表菌液原有浓度,以其作为计算杀灭对数的初始浓度。2.1.1.7.4 悬液定量杀菌试验操作程序(1)首先按产品说明书要求配制消毒液。无特殊说明者,一律使用无菌硬水配制,配制的浓度为待测浓度的 1.25 倍(例如要评价的消毒液浓度为 200mg/L,则应配制 250mg/L),置 201 水浴备用。(2)按照 2.1.1.2 配制实验用菌悬液,浓度为1108cfu/ml5108cfu/ml。(3)取消毒试验用无菌大试管,先加入 0.5ml 试验用菌悬液,再加入 0.5ml 有机干扰物质,混匀,置 201 水浴中 5min 后,用无菌吸管吸取上述浓度消毒液 4.0 ml 注入其中,迅速混
5、匀并立即记时。(4)待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间,分别吸取 0.5ml 试验菌与消毒剂混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中,混匀。(5)各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用 10min 后,分别吸取 1.0ml 样液,按活菌培养计数方法测定存活菌数,每管样液接种 2 个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时,可进行系列 10倍稀释后,再进行活菌培养计数。(6)同时用稀释液代替消毒液,进行平行试验,作为阳性对照。(7)所有试验样本均在 37 温箱中培养,对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果;对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。(8)试验重复 3 次,计算各组的活菌浓度(cfu/
6、ml),并换算为对数值(N),然后按下式计算杀灭对数值:杀灭对数值 (KL)对照组平均活菌浓度的对数值(No)试验组活菌浓度对数值(Nx)计算杀灭对数值时,取小数点后两位值,可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数,小于等于 1 时,其杀灭对数值,即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。2.1.1.7.5 载体浸泡杀菌试验操作程序(1)载体浸泡定量杀菌试验操作程序1)取无菌小平皿,标明所注入消毒液的浓度。按每片 5.0ml 的量,吸取相应浓度的消毒剂溶液注入平皿中。2)将盛有消毒剂平皿置 201 水浴箱内 5min 后,用无菌镊子分别放入预先制备的菌片 3 片,并使之浸透于
7、消毒液中。3)待菌药相互作用至各预定时间,用无菌镊子将菌片取出分别移入一含 5.0ml 中和剂试管中。用电动混合器混合 20s,或将试管在手掌上振敲 80 次,使菌片上的细菌被洗脱进入中和液中,再放置5min 以上,使中和作用充分。最终进一步混匀后,吸取 1.0ml 直接接种平皿,每管接种 2 个平皿,测定存活菌数。4)另取一平皿,注入 10.0ml 稀释液代替消毒液,放入 2 片菌片,作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。5)所有试验样本均在 37 温箱中培养,对细菌繁殖体培养 48h 观察最终结果;对细菌芽孢需培养 72h 观察最终结果。6)试验重复 3 次 (包
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