含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定(BJS 201915).doc
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1、1附件 4含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定 BJS 2019151 范围本方法规定了含乳饮料及其原料中酪蛋白四种亚型 s1-酪蛋白、s2-酪蛋白、-酪蛋白、-酪蛋白含量测定的方法。本标准适用于含乳饮料及其原料中酪蛋白总含量的测定,不适用于发酵法、酶解法、水解法等工艺对蛋白质改性的样品。2 原理试样溶液中的酪蛋白采用等电点沉淀后复溶,用胰蛋白酶进行酶解,同时加入同位素内标,C18水相柱分离,采用液相色谱-串联质谱仪检测,内标法定量。 3 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T 6682 规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 浓盐酸(HCl) 。3.1.2 甲酸(CH
2、2O2):质谱级。3.1.3 醋酸(CH3COOH):色谱级。23.1.4 氯化钠(NaCl) 。3.1.5 乙腈(CH3CN):质谱级。3.1.6 三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4H11NO3) 。3.1.7 聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100, C34H62O11) 。3.1.8 胰蛋白酶(Trypsin,C6H15O12P3):质谱级,猪源、牛源、基因工程来源均可;建议采用基因工程级的胰蛋白酶以降低杂酶的影响。3.2 试剂配制3.2.1 盐酸溶液(6 mol/L):吸取 25 mL 浓盐酸,用水稀释并定容至 50 mL。3.2.2 甲酸溶液(10% V/V):吸取 1 mL
3、甲酸,用水稀释并定容至 10 mL。3.2.3 醋酸溶液(0.3% V/V):吸取 0.3 mL 醋酸,用水稀释并定容至 100 mL。3.2.4 氯化钠溶液 (0.5 mol/L,含 0.2% Triton-X 100):称取 14.625 g,加 200 mL 水溶解后,加入 1 mL Triton X-100(3.1.7) ,混匀溶解后,用水定容至 500 mL。3.2.5 Tris-HCl 溶液(50 mmol/L):称取 6.057 g Tris,加 900 mL 水溶解,用 6 mol/L 盐酸溶液(3.2.1)调 pH 至 8.5 后,用水定容至 1000 mL,经 0.45 m
4、 微孔滤膜过滤,备用。3.2.6 胰蛋白酶液:用醋酸溶液(3.2.3)将胰蛋白酶粉末溶解至 1 mg/mL 后,按照单次使用量进行稀释分装,如每瓶 50 L 或 100 L 的 0.2 mg/mL 胰蛋白酶,-80C 冷冻保存,避免反复冻融。3.2.7 蛋白质浓度测定试剂盒(基于考马斯亮蓝-Bradford 测定法或 BCA 蛋白质测定法均可) 。3.2.8 甲酸水溶液(0.1% V/V):吸取 0.5 mL 甲酸,用水稀释并定容至 500 mL。33.3 标准品3.3.1 s1-酪蛋白特征肽标准品:YLGYLEQLLR,纯度须准确标定,或经国家认证的标准物质。3.3.2 s2-酪蛋白特征肽标
5、准品:FALPQYLK,纯度须准确标定,或经国家认证的标准物质。3.3.3 -酪蛋白特征肽标准品:VLPVPQK,纯度须准确标定,或经国家认证的标准物质。3.3.4 -酪蛋白特征肽标准品:YIPIQYVLSR,纯度须准确标定,或经国家认证的标准物质。3.3.5 s1-酪蛋白特征肽内标标准品:PSERYLGYL*(13C6,15N)EQLLRLKKY,HPLC 级纯度 98%。3.3.6 s2-酪蛋白特征肽内标标准品:RYQKFALPQYL*(13C6,15N)KTVYQ,HPLC 级纯度 98%。3.3.7 -酪蛋白特征肽内标标准品:SQSKVL*(13C6,15N)PVPQKAVPY,HPL
6、C 级纯度 98%。3.3.8 -酪蛋白特征肽内标标准品:KIAKYIPIQYVL*(13C6,15N)SRYPSY,HPLC 级纯度 98%。L*(13C6,15N)同位素标记亮氨酸,以上标准品的相对分子量见附录 A 表 A1。3.4 标准溶液配制3.4.1 标准储备溶液(400 mol/L):根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型(3.3.1-3.3.4)称样量,精确称取适量(精确至 0.01 mg)标准品后,用 Tris-HCl 溶液(3.2.5)溶解,定容于 10 mL 容量瓶中,各酪蛋白亚型特征肽(3.3.1-3.3.4)浓度均为 400 mol/L,此溶液密封后-2
7、0冷冻保存,有效期 3 个月。43.4.2 混合标准溶液:准确吸取各酪蛋白亚型特征肽标准储备液(3.4.1)1 mL 至 100 mL 容量瓶中,加入 Tris-HCl 溶液(3.2.5)稀释至刻度,得到各酪蛋白亚型特征肽浓度为 4 mol/L 的混合标准溶液,此溶液密封后-20冷冻保存,有效期 1 个月。3.4.3 混合标准工作溶液:准确吸取混合标准溶液(3.4.2) ,用纯水稀释,配制成浓度依次为 0.02 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、1.0 mol/L、2 mol/L 的系列混合标准工作液, -20冷冻保存,有效期 1 周。3.4.4 内标标准储备溶液(10 mo
8、l/L):根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型(3.3.5-3.3.8)称样量,精确称取适量(精确至 0.01 mg)内标标准品后,用 Tris-HCl 溶液(3.2.5)溶解,配制成各酪蛋白亚型特征肽(3.3.5-3.3.8)浓度均为 10 mol/L 的内标标准储备溶液,此溶液密封后-20冷冻保存,有效期 3 个月。3.4.5 内标混合标准溶液:准确分别吸取 0.25 mL 各酪蛋白亚型特征肽内标标准储备溶液(3.4.4)混合,配制成浓度为 2.5 mol/L 内标混合标准溶液 1 mL,-20冷冻保存,有效期 1 个月。3.4.6 混合标准品酶解溶液:分别准确吸取 50
9、0 L 各系列混合标准工作溶液(3.4.3)到 2 mL 低吸附聚丙烯(PP)离心管中,向每个浓度中加入 40 L 内标混合标准溶液(3.4.5) ,再加入 5 L的 0.2 mg/mL 的胰蛋白酶液(3.2.6) (含 1 g 胰蛋白酶) ,用纯水定容至 1 mL 后充分涡旋,在1000 r/min,4条件下,离心 1 min。盖紧瓶盖,在 37水浴或者恒温箱内孵育 15-16 h 后,取出加入 20 L 10% 的甲酸溶液(3.2.2)终止酶解反应。混匀后,在 10 000 r/min,4条件下离心 10 min,静置,取上清液备用。上清液在-20冷冻保存放置 4-5 天内稳定。3.5 材
10、料3.5.1 低吸附型 2 mL、15 mL、50 mL 聚丙烯(PP)离心管。53.5.2 低吸附型聚丙烯(PP)枪头。3.5.3 低吸附型聚苯乙烯(PS)96 孔板(用于总蛋白含量测定) 。4 仪器和设备4.1 高效液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源。4.2 酶标仪。4.3 分析天平:感量分别为 0.001 g、0.000 1 g 和 0.000 01 g。4.4 低温离心机:转速6 000 r/min。4.5 恒温水浴锅或可控温培养箱。4.6 pH 计。4.7 涡旋振荡器。5 分析步骤5.1 试样蛋白提取含乳饮料固体试样(若含乳包装为独立包装,应与其他调味粉末混合后取样,例如:咖啡、
11、奶茶等饮品):试样称取 1 g5 g (精确至 0.001 g) 于锥形瓶中;若为乳饮料液体试样:精密量取试样 10 mL 于锥形瓶中,加入 30 mL 预温(40)的 Tris-HCl 溶液(3.2.5) ,混匀后,放入 60水浴恒温振荡 1 h,取出冷却后用 Tris-HCl 溶液(3.2.5)转移定容至 50 mL 容量瓶(V溶解体积) 。乳粉原料粉试样:称取试样 0.5 g1 g (精确至 0.001 g) 于锥形瓶中;若为液体乳试样:精密量取试样 12 mL 于锥形瓶中,加入 30 mL 预温(40)的 Tris-HCl 溶液(3.2.5) ,混匀后,放6入 60水浴恒温振荡 1 h
12、,取出冷却后用 Tris-HCl 溶液(3.2.5)转移定容至 50 mL 容量瓶(V溶解体积) 。精密量取 10 mL(V沉淀体积)上述完全溶解的试样溶液(视检无明显结块) ,按体积比(v/v =1:1)加入 10 mL 氯化钠溶液(3.2.4), 涡旋振荡。混匀后,用 10% 甲酸溶液(3.2.2)调节试样的 pH 值到 4.64.8 之间,2-8条件下静置过夜,待所有蛋白沉淀析出。已析出的沉淀试样在10000 r/min,4条件下离心 15 min,弃去上清液,沉淀以备复溶。5.2 试样复溶向上述沉淀试样(5.1)中加入 5 mL Tris-HCl 溶液(3.2.5) ,涡旋振荡 510
13、 min,使溶液充分溶解,放入 60水浴恒温振荡 30 min,取出后继续混匀(视检无明显结块) 。试样溶液在 10 000 r/min, 4条件下离心 15 min,弃去沉淀,留取上清液。上述步骤重复 1 次,合并两次复溶的上清液后,可用 Tris-HCl 溶液(3.2.5)定容至 10 mL(V复溶体积) 。5.3 试样总蛋白的含量测定按照 Bradford 或 BCA 法试剂盒所述方法测定复溶试样溶液(5.2)中总蛋白质的含量(单位:mg/mL) 。5.4 试样的稀释为保证该实验在最佳的酶解效率下进行,需根据试样中总蛋白的含量测定结果(5.3), 用Tris-HCl 溶液(3.2.5)对
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- 饮料 及其 原料 蛋白 含量 测定 BJS201915
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