2018年肾活检病理规范化诊断专家共识.pdf
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1、肾活检病理检查可明确肾脏疾病的病理改变和病理类型, 对于肾脏疾病的诊断、 治疗方案制定、 预后判断等具有重要意义; 同时, 对于揭示肾脏疾病的发病机制、 发现新的肾脏疾病也可提供重要信息和诊断依据。此外,通过对肾脏病理资料的系统分析、 重复肾活检病理的比较以及作为临床试验的疗效评估指标等, 肾活检病理检查也是临床科研的重要组成部分。因此, 规范化开展肾活检病理检查及病理诊断至关重要。常规的肾活检病理检查, 应包括光学显微镜 (光镜) 、 免疫病理 (免疫荧光为主) 及电子显微镜 (电镜) 检查, 3 种检查反映的病理改变的重点不同, 相互结合和补充, 才能做出规范化的病理诊断。近年来, 随着新
2、技术包括基因检测及生物质谱等在临床疾病诊断及研究中的应用, 肾脏疾病的病因学及其发病机制研究方面取得了巨大的进展, 因而国际上提出了基于病因学和病生理发病机制的肾脏疾病的病理新分类及新的肾脏病理诊断模式1。长期以来, 我国的肾活检病理缺乏统一的、 规范化的病理诊断模式, 很多单位在肾活检组织的标本制备及阅片诊断等方面存在较大差异,影响了肾活检病理诊断的水平, 既不利于患者的治疗, 也不利于临床科研合作及国内外的学术交流。为了适应现代化诊疗模式以及精准化医疗的需求, 同时与国际肾脏病理的诊断理念接轨, 我们参阅国际肾脏病理学界的病理诊断模式, 经过国内同行对肾活检病理诊断的取材与制片技术、 病理
3、观察与诊断流程及病理报告模式等系统的文献检索及反复讨论, 制定了肾活检病理规范化诊断的专家共识, 供我国的临床及病理医师、 技术人员及科研工作者参考使用。一、肾活检标本的取材、 分割与保存肾活检常用的取材方式包括开放式肾活检和 B 超引导下经皮肾穿刺活检, 以后者为主, 目前采用的多是半自动肾活检枪。尽管在超声引导下肾活检通常是十分安全的, 但其毕竟是有创检查, 可能会出现一定比例的并发症。因此, 临床医师应该严格掌握肾活检的指征, 权衡患者肾活检的风险和肾活检的必要性; 同时, 对于严重的并发症如穿刺后出血, 应有进行血管栓塞或泌尿外科手术的治疗措施作为保障。为了获得理想的肾活检标本, 以满
4、足完善的病理检查所需, 同时又尽可能降低并发症的发生, 通常建议成人使用14G、 16G或18G的穿刺针, 而小于 8 岁的儿童使用 16G 或 18G 的穿刺针2-6。开放式肾活检临床很少应用, 可用于不具备经皮肾活检的条件而又必须进行肾活检的患者, 或泌尿外科行部分肾切除时同时切取肾组织, 或移植供肾获取时活检和零点肾活检等。肾穿刺取材时应有病理技术员到现场进行穿刺组织的辨认、 分割和记录, 临床医师应提前准备和填写好病理申请单。病理申请单应包括 3 部分内容, 一是由临床医师填写患者的基本信息、 病史摘要 (包括简要病史、 主要体征、 主要的实验室检查和辅助检查等以提供诊断依据) 、 临
5、床诊断等; 二是由病理技术员填写取材情况和留取样本的标记包括穿刺针数、 获取组织的条数及长度以及分割为光镜、 免疫荧光和电镜的组织块数目、 大小等;三是由病理诊断医师填写病变所见和病理诊断。合格的肾活检标本应该包含肾皮质和皮髓交界的 23 条肾组织, 长度为1.01.5 cm。为保证取材的质量, 肾组织取出后应在解剖镜下进行初步观察, 确认穿刺组织为肾皮质及肾小球的大致数量, 并尽快分割后放入相应的固定液或保存液。肾活检组织通常要分成 3 部分, 分别进行光镜、 免疫荧光和电镜检查。肾活检标本的光镜检查组织至少应有 10 个肾小球, 以局灶性病变为主的肾小球疾病(如局灶节段性肾小球硬化) 建议
6、应包含 25 个以上肾小球, 免疫荧光检查组织至少应有 4 个肾小球, 电镜检查组织至少应有 2 个肾小球。若是移植肾活检, 光镜检查的组织至少应有 2 条肾组织, 含皮质及皮髓交界, 包含至少10 个肾小球, 同时包含至少 2 条小动脉2-7。合理的肾活专家共识肾活检病理规范化诊断的专家共识肾活检病理规范化诊断共识专家组注: A: 取到 1 条肾组织的分割方法; B: 取到 2 条肾组织的分割方法; C: 取到3条肾组织的分割方法图1肾活检组织的分割取材示意图皮质端皮质端皮质端髓质端髓质端髓质端ACB免疫荧光 电镜光镜免疫荧光 电镜光镜电镜光镜电镜免疫荧光电镜光镜光镜DOI: 10.3760
7、/cma.j.issn.10017097.2018.12.013通信作者: 赵明辉, 100034 北京, 北京大学第一医院肾内科北京大学肾脏疾病研究所, Email: 中华肾脏病杂志2018年12月第34卷第12期Chin J Nephrol, December 2018, Vol. 34, No.12941检标本的分割也十分关键, 通常在皮质端分割相应的组织分别供免疫荧光和电镜检查, 其他剩余组织用于光镜检查。肾活检组织分割方法示意图见图1。肾活检组织分割后应及时放入相应的固定液或保存液, 通常要求取材后尽快 (建议不超过3 min) 完成。建议首先将免疫荧光检查的组织放入组织保存液 (M
8、ichel 或Zeus 保存液) ; 其次, 将电镜检查的组织置于 2.5%戊二醛固定液 (0.1 mol/L 磷酸缓冲液配置) , 光镜检查的组织放入10%中性甲醛固定液。特别提醒注意的是, 夹取3种检查组织的镊子要分开专用, 特别是免疫荧光的组织切忌不能沾染固定液, 否则, 会严重影响免疫荧光标记的结果。也可将免疫荧光检查组织在现场用OCT包埋并冻存于便携式液氮罐内。肾活检标本应置于04保温桶内运输, 或可暂时储存于冰箱冷藏室 (04) 。对于肾活检组织的固定、 运输及储存的所有环节, 切忌发生组织冷冻, 以免影响组织细胞结构的保存。二、肾活检病理检查的标本制备、 切片与染色制备高质量的病
9、理切片包括光镜、 免疫荧光和电镜检查, 是进行规范化肾活检病理诊断的前提。此外, 少数特殊病例还需要进行石蜡免疫荧光、 免疫组化、 免疫电镜、 原位杂交等检查, 以协助明确诊断。1. 光镜标本的制备与染色:常规光镜检查的石蜡切片厚度通常为2 m, 切取连续切片812张, 每张玻片上捞取24张切面。常规染色应包括4种, 分别是苏木素伊红染色 (HE) 、 PAS 染色 (PAS) 、 马松三色染色 (Massontrichrome) 和六胺银染色 (periodicacid silver methenamine,PASM) 。每种染色显示的主要病变各有不同。HE 染色可以观察细胞的形态和种类、
10、色素颗粒、 坏死病变以及各种结晶和管型等; 必要时辅以偏振光, 有助于判断结晶的性质, 如草酸盐结晶有折光性, 磷酸盐结晶无折光性。PAS 染色主要显示糖蛋白, 因此可以观察细胞的基底膜、细胞外基质和一些细胞内蛋白, 因此是肾活检组织光镜病理检查的必备染色, 对于观察基底膜病变、 细胞外基质的增多、 各种细胞的增生及渗出、 鉴别沉积的物质是否富含糖链等病变具有优势。马松三色染色既可以显示基底膜、 细胞外基质和间质的胶原纤维, 也可以显示嗜复红蛋白沉积、 纤维素渗出和血栓形成, 因此, 主要用以观察免疫复合物的沉积部位、 纤维素样坏死和肾间质纤维化等病变程度。六胺银染色可以更清晰地显示基底膜病变
11、与细胞外基质增多, 便于对基底膜的钉突、 链环和双轨征的观察, 同时, 也可以观察鲍曼囊壁、 动脉的血管弹力膜和嗜银蛋白的沉积等。此外, PASMMasson 套染在银染的基础上, 同时可以观察嗜复红蛋白的沉积部位、 纤维素样坏死和血栓等病变, 推荐使用该染色8。此外, 对于一些少见的病变和特殊的病理类型还需要进行其他特殊染色。如淀粉样变性, 应切厚片, 68m, 行刚果红染色, 并需要在偏振光显微镜下观察是否有苹果绿橙黄色的双折光; 怀疑脂质沉积时, 应用冰冻切片进行油红O染色; 怀疑含铁血黄素时, 需行普鲁士蓝染色。von Kossa 染色主要显示磷酸钙的沉积。PAS 或银染还可以初步观察
12、真菌, 抗酸染色可以观察结核杆菌等。2. 免疫荧光 (IF) 和免疫组化的切片与免疫标记:免疫病理检查包括冰冻切片的IF染色或石蜡切片的免疫组化染色。推荐使用冰冻切片, 采用直接 IF 法检查。若标本储存和运送的时间较长, 则需要置于荧光标本保存液(Michel或Zeus液) 中运输; 因荧光信号易于衰减或淬灭,无法长期保存, 应及时拍照存储。冰冻切片厚度一般为3 m, 常规 IF 检查项目应包括免疫球蛋白(IgG、 IgA、IgM) 、 补体 (C3、 C1q) 和轻链 (、 ) 染色。对于特殊病例,还需加做其他染色, 如淀粉样变前体蛋白 (AA 等) 、 纤连蛋白、 型胶原、 型胶原链、
13、乙型肝炎病毒抗原、 丙型肝炎病毒抗原等; 对于膜性肾病, 需要加做 IgG 亚型和磷脂酶 A2 受体 (PLA2R) 。对于移植肾标本, 还应加做 C4d和BK病毒染色。高质量的免疫荧光染色, 需要建立稳定的、 易于操作的实验流程和质控标准, 包括设立严格的阴性和阳性对照, 以保证免疫荧光染色的高敏感性和特异性。免疫组化染色主要作为免疫荧光染色的补充方法,用于细胞内表达抗原的检测和细胞表型的鉴定等, 如病毒抗原包括BK、 巨细胞病毒 (CMV) 等病毒抗原染色及近端肾小管上皮内结晶成分鉴定等; 对于淋巴增殖性细胞的表型鉴定, 如淋巴细胞 (B或T细胞) 、 浆细胞、 巨噬细胞等。此外, 石蜡切
14、片的 IF 检查对于诊断单克隆丙种球蛋白病相关肾损害较有价值, 对于常规的直接法冰冻切片IF出现单克隆免疫球蛋白 (MIg) 假阴性时, 运用石蜡包埋组织切片的酶消化后 IF 检查, 可提高 MIg 检查的敏感性。如果 IF 未取到肾小球或 IF 样本保存不当时, 可利用石蜡切片进行抗原修复后再进行 IF 或免疫组化染色, 作为IF检查的一种替补手段9。3. 电镜样本的制备、 超薄切片及染色:电镜检查在肾脏疾病的病理诊断中具有不可替代的作用。所有的自体肾活检组织应常规进行透射电镜检查, 移植肾标本建议应留取电镜标本, 必要时进行电镜检查以辅助诊断。电镜样本的及时固定是保证超微结构清晰的关键步骤
15、, 组织离体后应在1 min内放入2.5%3.0%戊二醛固定液中,随后进行1%四氧化锇后固定及后续标本制备过程, 通常由专业的电镜实验室完成。依次进行系列丙酮脱水、 浸透及树脂包埋剂 (多采用 Epon812) 包埋, 制成树脂包埋块; 然后, 进行1 m厚半薄切片, 经过甲苯胺蓝染色后选取肾小球及感兴趣的病变部位行超薄切片, 应避免选取硬化的和结构破坏的肾小球, 最后经过醋酸铀和枸橼酸铅染色, 在透射电镜下进行观察和数码照相。对于无电镜标本或电镜标本无肾小球时, 也可以用石蜡标本改作电镜标本, 尽管组织细胞的超微结构稍差。但对于基底膜的结构、 电子致密物的沉积仍能较准确地判断, 可以为中华肾
16、脏病杂志2018年12月第34卷第12期Chin J Nephrol, December 2018, Vol. 34, No.12942病理诊断提供必要的信息。少数特殊情况下, 通过胶体金标记的免疫电镜技术, 也可以协助疾病的诊断和分型,如副蛋白相关肾损害的早期病变诊断10。三、肾活检病理阅片的基本原则与诊断思路规范化的肾活检病理阅片以及病理诊断思路, 对于做出正确、 全面的肾脏病理诊断至关重要。因此, 系统、细致的病理阅片, 从光镜组织病理水平、 免疫荧光和免疫组化的免疫病理方面以及电镜超微病理水平等进行多层次的观察, 将各种病理检查的病变特点进行整合, 并与临床表现进行关联分析, 对最终准
17、确的病理诊断是非常重要的诊断程序。基于病因学和发病机制的病理诊断, 能为临床上的疾病诊断、 治疗和预后提供必要的信息。1. 肾活检病理阅片的基本原则和规范要求:首先要进行切片组织样本的核对, 包括与病理申请单上的患者信息和病理编号进行核对, 与肾活检取材时记录的大体样本核对, 包括光镜样本、 免疫荧光样本和电镜样本的组织大小与块数等, 确保患者与观察样本的对应无误。通常需要建一个包含病理申请单上的患者信息、 样本来源信息、 取材时间及其编号 (包括光镜、 免疫荧光和电镜的编号) 在内的病理标本登记本 (或电子表格) 。每种病理检查阅片前, 需要核对上述信息。光镜组织病理学观察能够反映肾脏整体病
18、理改变的特点, 包括肾小球、 肾小管、 肾间质以及肾血管等各个部位的组织结构改变、 外来的免疫沉积物及其分布范围和严重程度, 是反映肾脏病理改变的基石。从低倍整体观察, 到高倍具体病变的辨别, 并在不同染色切片进行分析比对。首先对活检组织的取材状况及突出病变进行整体评估, 包括活检组织块的大小和数目、 皮质和髓质的比例, 硬化的肾小球及可观察肾小球的数目、 肾小球的体积及血液灌注状态等。肾小球病变的观察包括系膜病变(系膜细胞增生、 系膜基质增多、 系膜区增宽、 系膜结节状硬化、 分叶状改变、 系膜溶解及系膜沉积物等) 、 毛细血管腔内病变 (毛细血管腔内细胞增多、 中性粒细胞浸润、 血栓、 白
19、金耳结构、 透明血栓、 脂蛋白栓塞等) 、 肾小球毛细血管壁病变 (肾小球毛细血管壁皱缩、 血栓性微血管病样病变、 基底膜增厚、 钉突样或链环样改变、 双轨征及睫毛状或毛刺样改变) 、 肾小球毛细血管袢病变 (纤维素样坏死、 节段性硬化、 球囊粘连等) 、 毛细血管外病变即新月体形成 (细胞性、 细胞纤维性及纤维性新月体) 和鲍曼囊壁病变 (球囊滴状变性、 囊壁增厚、 囊壁断裂、 囊周纤维化等) 。肾小管间质病变的观察, 包括急性病变和慢性病变的观察。急性肾小管损伤观察肾小管上皮细胞坏死、 空泡变性、 蛋白质吸收滴、 刷状缘脱落、 崩解及再生、 裸基底膜等; 急性间质性肾炎观察肾间质水肿及炎症
20、病变的面积、 部位 (在皮质、 髓质的分布) 以及浸润的细胞成分 (淋巴、 单核巨噬细胞, 嗜酸性或中性粒细胞、 浆细胞等) 等;对肾小管腔内管型(红细胞管型、 白细胞管型、 TammHorsfall 蛋白管型、 骨髓瘤管型) 、 肾小管间质内结晶 (尿酸盐、 草酸盐、 磷酸盐等) 及肉芽肿结构等逐一观察。移植肾标本还需要对肾间质炎症、 肾间质出血、 肾小管炎、管周毛细血管炎以及肾小管上皮内病毒包涵体等观察及半定量评估。肾间质纤维化伴肾小管萎缩 (IFTA) 病变,应根据其占肾皮质面积的比例, 分为轻度 (25%) 、 中度(26%50%) 及重度 (50%) 进行描述。肾血管病变的观察, 常
21、见病变包括细小动脉的玻璃样变性和小叶间动脉内膜增厚及管腔狭窄, 其他血管病变包括血管壁纤维素样坏死、 血管炎、 动脉内膜炎以及血栓性微血管病 (包括小动脉内膜黏液样水肿、 洋葱皮样增生及血栓形成) 等。通常对动脉内膜纤维性硬化病变进行半定量评分, 根据动脉管腔狭窄的比例, 分为轻度 (25%管腔狭窄) 、 中度 (26%50%管腔狭窄) 及重度 (50%管腔狭窄) 。免疫荧光检查能够检测肾组织内沉积的各种免疫球蛋白及轻链的种类、 补体成分、 纤维蛋白原或其他特殊蛋白 (淀粉样蛋白) 等, 也可检测构成免疫复合物的抗原成分, 如乙型肝炎病毒抗原、 PLA2R 等, 因而能够初步反映肾小球疾病的发
22、病机制以及提供相关病因学证据。免疫荧光检查的结果判定应对全部标本进行详细观察, 包括皮质及髓质区, 记录肾小球的总数目、 硬化及节段性硬化的肾小球数目、 伴毛细血管袢坏死及含新月体的肾小球数目等, 观察荧光阳性的成分、 强度、 分布方式及沉积部位等。通常根据荧光强度分为 4 级 (-, , +, 2+, 3+) ; 荧光的分布方式描述为线样、 细颗粒状、 粗颗粒状、 团块状、花瓣样、 条带样或片块状等; 荧光阳性的部位, 包括系膜区、 肾小球毛细血管壁、 鲍曼囊壁、 肾小管上皮及肾小管基底膜、 肾间质和血管壁等, 对于肾小球的分布范围可描述为弥漫性、 局灶性、 球性或节段性, 需要具体描述荧光
23、阳性的肾小球比例及其阳性部位, 对于管型的阳性成分,重点比较两种轻链的荧光强度。值得注意的是, IgM、 补体C3和C1q在肾小球节段性硬化病灶或瘢痕组织上均可呈节段阳性。且大多数肾间质、 血管壁可见局灶性 C3 阳性, 而肾小管管型则呈现 IgA、 和同时阳性。这些可作为荧光染色质量的内部阳性对照。电镜检查具有高分辨性能特点, 能够观察光镜难以分辨的早期和细微结构异常, 同时也可对表现为电子致密物的免疫复合物进行精确定位, 因而能够弥补光镜和免疫荧光检查的不足。电镜检查主要在肾小球疾病的诊断中具有重要价值。电镜观察时首先低倍下分辨肾小球及肾小管, 对肾小球的结构进行详细观察, 包括足细胞结构
24、及足突融合程度、 基底膜厚度与其结构、 内皮细胞内管网状结构、 内皮下内疏松层增宽、 电子致密物的沉积部位(上皮下、 基底膜内、 内皮下及系膜区) 、 特殊亚结构 (纤维丝、 微管、 结晶、 胶原纤维、 髓磷脂样小体、 脂蛋白空泡等) , 并在高倍对基底膜厚度、 纤维丝及微管的直径等进中华肾脏病杂志2018年12月第34卷第12期Chin J Nephrol, December 2018, Vol. 34, No.12943行测量。还要观察肾小管上皮细胞内特殊包涵体如结晶、 病毒颗粒等、 肾小管基底膜的电子致密物沉积、 肾间质的浸润细胞类型、 管周毛细血管基底膜的分层化 (针对移植肾标本) 等
25、。2. 肾活检病理的整合诊断思路:肾活检病理诊断需要将光镜、 免疫荧光和电镜检查的病理特点进行整合分析, 最后还需要结合临床和实验室检查, 得出最终的病理诊断。通常根据光镜观察结果, 对肾活检组织的基本病理改变有整体的把握, 判断出病变的主要部位, 是以肾小球病变为主, 还是以肾小管间质病变或血管病变为主,或是两个以上部位病变同时存在; 其次, 判断病变的分布范围、 急慢性特点、 病变的严重程度等, 如局灶性或弥漫性、 节段性或球性、 增生性或非增生性、 坏死性或硬化性等。进一步根据免疫荧光特点, 判断肾脏疾病是否为免疫复合物介导, 是否提示补体介导, 有无单克隆免疫球蛋白相关肾病的证据等。通
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