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1、作者:王莉(1983.07),女,江苏,硕士,生物化工专业,E-mail: *通讯作者:姚全胜,男,教授,博士生导师,E-mail:YaoQStom.Com毛蚶多糖(毛蚶多糖(ASLP)免疫调节作用的研究)免疫调节作用的研究王莉王莉1 1,何赟绵,何赟绵2 2,姚全胜,姚全胜* *3 3(1(1南京工业大学,江苏,南京南京工业大学,江苏,南京 210009210009;2 2中国药科大学,江苏,南京中国药科大学,江苏,南京210009210009;3 3江苏省药物安全评价中心,江苏,南京江苏省药物安全评价中心,江苏,南京 210009)210009)摘要摘要:目的目的:研究毛蚶多糖(ASLP)
2、对正常小鼠免疫功能的影响。方法方法:通过体外方法研究毛蚶多糖(ASLP)对脾淋巴细胞和对 T、B 淋巴细胞增殖能力的影响以及淋巴细胞产生 IL-2 的影响;体内研究小鼠体重、脏器指数和碳廓清能力以及 ConA 诱导脾淋巴细胞转化的能力来观察毛蚶多糖(ASLP)对小鼠免疫功能的影响。结果结果:体外试验中,毛蚶多糖(ASLP)增强淋巴细胞的增殖能力以及 IL-2 的活性,与对照组有显著性差异(P0.05,P0.01) ;体内试验中,中、高剂量组的脏器指数和吞噬指数、校正吞噬指数以及淋巴细胞转化率与对照组相比有明显差异(P0.05,P0.01) 。结论结论:毛蚶多糖(ASLP)对小鼠的免疫功能一定的
3、调节作用,是一种良好的免疫调节剂。关键词:关键词:毛蚶;多糖;免疫调节;淋巴细胞;碳廓清Studies on Immunomodulation of Polysaccharide from Arca subcremata LischkeWang Li1,He Yun-mian2,Yao Quan-sheng3*(1.Nanjing University of Technology,Nanjing210009,China;2.China Pharmaceutical University, Nanjing210009,China; 3. Jiangsu Center for Safety Eva
4、luation of Drugs, Nanjing210009, China )Abstract: OBJECTIVE: Study the effects of Polysaccharide from Arca subcremata Lischke(ASLP) on immune in normal mice. METHODS:Study the cell multiplication of splenic lymphocyte and T、B lymph cell in vitro. Investigate the body weight、 the index of immune orga
5、ns and carbon granula test to determine effects of ASLP on immune function in vivo. RESULTS: In vitro tests the ASLP can enhance the ability of cell multiplication of splenic lymphocyte and T、B lymph cell, higher than that of ctrol group(P0.05,P0.01). In vivo tests the the index of immune organs and
6、 the .The macrophage engulfing carbon granula ability in middle and high dosage treatment are higher2than the control group(P0.05,P0.01). CONCLUSION:CONCLUSION: The results indicated that the ASLP could improve the immunological function of mice. It would be a good immunomodulater.Key words: Arca su
7、bcremata Lischke; Polysaccharide; immunomodulation; lymphocyte; engulfing carbon granula毛蚶(Arca subcremata Lischke)属于软体动物门、瓣鳃纲、翼形亚纲、蚶目、蚶科,毛蚶属,俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子等,广泛分布于日本、朝鲜、中国沿岸。在中国北起鸭绿江,南至广西均有分布,以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等浅水区资源尤为丰富1。毛蚶其壳和肉皆有药用价值。中医学上认为它具有健胃、温中、益血、消瘕化食、散淤、润五脏、利关节等作用,毛蚶多糖(ASLP)是毛蚶具有免疫增强作用和抗肿瘤作用的的活性成分
8、。本文从体内和体外两个方面讨论了毛蚶多糖(ASLP)的免疫学作用,为进一步研究毛蚶的药用价值,深入开发海洋药用资源打下了基础。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 仪器恒流泵 HL-2(上海沪西分析仪器厂),自动部分收集器 BSZ-100 型(上海沪西分析仪器厂),CO2培养箱(美国 ThermoForma 公司),循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司),旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),冷冻离心机(日本 HITACHI 公司),DG5032 型酶联免疫检测仪(美国 Bio-Rad 公司),UV2000 型分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)1.1.2 试剂小牛血清(Hyclone,南京生兴生
9、物工程有限公司); DEAE-52 阴离子交换柱(Whatman);刀豆蛋白 A(Con A,Sigma);噻唑蓝(MTT,Sigma),RPMI-1640(Gibco)培养液(含 10%的小牛血清,青、链霉素各 100 Uml-1);其他试剂均为分析纯。1.1.3 动物:8 周龄 ICR 小鼠,南京医科大学,202g,清洁级,批号:SCXKC苏 72008-00431.1.4 毛蚶多糖的提取与纯化采用水提醇析法,毛蚶粉碎匀浆,用丙酮脱色干燥,80水浴浸提(3 次) ,Sevag 法脱蛋白,离心,乙醇沉淀,洗涤冷冻干燥,DEAD-52 柱层析,Sephadex G-200 柱层析,透析浓缩,冷
10、冻干燥,得到纯品毛蚶多糖(ASLP) ,供实验室用。1.2 实验方法1.2.1 毛蚶多糖(ASLP)对脾淋巴细胞增殖能力的影响采用 MTT 法测定小鼠脾淋巴细胞增殖能力,无菌制备脾淋巴细胞悬液,用含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液调整细胞浓度为 6-8106ml-1。于 96 孔培养板中,每孔加入 100l 细胞悬液,再加 100l 培养液(空白对照) 、10gml-1ConA(阳性对照)及含有不同浓度的样品溶液(400gml-1-1000gml-1) ,置 5%CO2 37培养 48h。培养结束前 4h,于每孔加入5mgml-1的 MTT 20l,培养结束后,每孔加入 DMSO
11、100ul,于酶标仪 570nm处测 OD 值,计算增殖指数 SI 2。样品孔的吸光值 SI= 阴性对照孔的吸光值1.2.2 毛蚶多糖(ASLP)对 T、B 淋巴细胞增殖的影响采用参考文献 4 中的方法分别提取 T、B 细胞悬液,用 MTT 法测定 T,B淋巴细胞增殖能力,用培养液作为空白对照、10gml-1Con A 及 10gml-1LPS 作为阳性对照,在酶标仪 570nm 测各孔 OD 值,计算增殖指数 SI3。表 1 毛蚶多糖(ASLP)对脾淋巴细胞以及 T、B 淋巴细胞增殖能力的影响(n=6,)xsTab 1 The effect of ASLP on proliferation
12、of splenocyte, B cells and T cells in mouse spleen. (n=6,)xsASLP/1g ml GroupPositiveLPS/ 51g mlConA/ 101g ml800400200100splenocyte3.50 0.151.600.182.600.183.500.15*3.220.16*3.000.13*2.440.114B cell1.00 0.14*3.61 0.15*1.23 0.113.22 0.12*2.84 0.16*2.42 0.12*1.62 0.11*T cell1.00 0.101.32 0.112.910.13 3
13、.44 0.103.18 0.112.82 0.142.60 0.12注:与对照组比较有显著性差异(P0.01) ;*与 Con A 比较有显著性差异(P0.01) ;与 LPS 比较有显著性差异(P0.01) 。Compared with control group(P0.01), * Compared with Con A(P0.01), Compared with LPS(P0.01)测定结果见表 1,毛蚶多糖(ASLP)体外能明显刺激并促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,并且其作用随着多糖浓度的变化而不同。在 100gml-1-800gml-1的浓度范围内,随着多糖浓度的上升,其刺激作用不断的增
14、强,说明毛蚶多糖(ASLP)对脾淋巴细胞增殖活性有明显的剂量依赖性。由于 Con A 和 LPS 分别只能刺激 T 和 B 细胞,因此可将分离到的 T、B 细胞分别用 Con A 和 LPS 刺激来考察分离效果,其中不同浓度的 ASLP 对小鼠脾脏的 T、B 淋巴细胞具有显著的刺激增殖的作用,并且在 100gml-1-800gml-1这一剂量范围内,T,B 淋巴细胞的增殖作用随毛蚶多糖(ASLP)的剂量的变化而变化,说明 T,B 淋巴细胞的增殖对剂量有一定的依赖性。1.2.3 毛蚶多糖(ASLP)对小鼠脾细胞产生 IL2 的影响1)IL2诱生 无菌制备小鼠脾淋巴细胞悬液,用RPMI-1640完
15、全培养液配成1107 ml-1,每孔加入3gml-1的ConA和不同浓度的ASLP溶液100l,每组设46个复孔,置于5CO2 37培养箱中孵育48h,离心吸取上清,即为IL-2代测样。2)IL-2活性检测 常规制备小鼠胸腺细胞细胞悬液,调整浓度为1107ml-1内含3gml-1的ConA 1ml,吸取细胞悬液加置96孔板,100l孔-1。然后加入制备的IL-2代测上清,并设阳性对照,阴性对照,置5CO2 37培养箱中培养72h,每孔加入20l MTT,继续培养4h,吸弃上清每孔100l,加入100l孔-1二甲基亚砜,振荡5min,于酶标仪492nm处测OD值4-5。表 2 毛蚶多糖(ASLP
16、)对脾淋巴细胞 IL-2 的影响(n=6,)xsTab 2 The effect of ASLP on Spleen lymphocytes generate IL-2(n=6,)xs5与对照组比较有显著性差异(P0.01) 。 Compared with control group(P0.01)。1.2.4 小鼠体内免疫实验剂量选择,设计了高、中、低 3 个剂量组(10 只) ,即小鼠每日每只口服给予毛蚶多糖(ASLP) 200mgkg-1(高剂量) 、100mgkg-1(中剂量) 、50mgkg-1(低剂量) ,对照组口服生理盐水,连续给药 15d。1) 免疫器官胸腺、脾脏指数的测定最后一
17、次给药后,颈椎脱臼处死小鼠,称重,取出小鼠脾脏、胸腺称重,并计算脏器指数。脏器指数()脏器重量(g)/动物重量(g)100表 3 毛蚶多糖(ASLP)对小鼠体重及脏器指数的影响(n10,)xsTab 3 The effect of ASLP on the weight and index of immune organs in mice(n=10,) xsGroup Dose / 1mg kgWeight /g Thymic index /1mg gSpleen index /1mg gControl groupSodium Chloride 28 5.222.920.494.120.79Lo
18、wdose group5025.8 2.573.181.054.180.66Middle dose group10026.5 3.373.230.974.210.44High dose group20026.5 2.423.110.594.380.38与对照组比较有统计学差异(P0.05) 。Compared with control group(P0.05)喂养 15d 后,毛蚶多糖(ASLP)对小鼠的体重无明显影响,对小鼠的免疫器官的脏器指数的影响在中、高剂量时有较为显著性的差异(P0.05) ,见表ASLP/1g ml Grouppositive control 800400200100
19、IL-2/A5700.3020.0060.354 0.0153.22 0.160.302 0.0170.244 0.01163。2) 小鼠碳廓清试验试验动物给药 15 天后,按 0.1ml/10g 体重计算,小鼠尾静脉注射印度墨汁(用生理盐水稀释 5 倍) ,分别在注射 2min、10min 从眼眶静脉丛取血 20l,加入到 2ml 0.1Na2CO3溶液中,以 Na2CO3溶液作空白,600nm 波长比色测OD 值,并将小鼠处死,取肝脏、脾脏称重。计算吞噬指数(K)及校正吞噬指数(a),表示小鼠碳廓清的能力5。吞噬指数 K,校正吞噬指数 a=logA1 12ttl ogA23K体重 肝重脾重
20、K:直线斜率,可表示吞噬速率;a:反映每单位组织重量的吞噬活性表 4 毛蚶多糖(ASLP)对小鼠碳廓清能力的影响(n10,)xsTab 4 The effect of ASLP on engulfing carbon granula ability in mice(n=10, )xsGroupDose /1mg kgPhagoccytosis index/KRevised phagocytosis index/aControl groupSodium Chloride0.0270.0083.050.38Low dose group500.0290.0095.151.04Middle dose
21、group1000.0320.0065.580.74High dose group2000.0300.0045.430.56与对照组比较有统计学差异 P0.05 ,与对照组比较有显著性差异(P0.01) 。Compared with control group(P0.05/P0.01)从表 4 可以看出,喂养 15d 后,毛蚶多糖(ASLP)的高、中剂量组的吞噬指数和校正吞噬指数与对照组均有比较显著性的差异(P0.05/P0.01) ,表明毛蚶多糖能增强巨噬细胞的吞噬功能,加速碳粒的清除。3) ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验于末次给药后次日脱颈处死动物,称重,无菌取出脾脏,在 200
22、目不锈钢筛上轻轻研磨过网,制成脾细胞悬液。用 Hanks 洗涤 3 次,用含 10%小牛血清的 RPMI-1640 制成 2106ml-1的脾细胞悬液,将每只小鼠的细胞悬液分两孔加入724 孔培养板中,每孔 1ml。其中一孔加入 Con A(5gml-1)50L,另一孔作为对照组,置 5%CO2,37培养 72h,培养结束前 4h,每孔轻轻吸去上清0.7ml,加不含小牛血清的 RPMI-1640 培养液 0.7ml,同时加 MTT(5mgml-1)50l孔-1,继续培养 4h。加入 DMSO 1ml 裂解细胞,吹打紫色结晶使之完全溶解,在 570nm 处测定吸光值(A570)6。从表 5 毛蚶
23、多糖(ASLP)在高、中剂量组时,能促进脾淋巴细胞的转化能力,与对照组有显著性差异(P0.05/P0.01) 。表 5 毛蚶多糖(ASLP)对小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响Tab The effect of ASLP on spleen lymphocytes induced by ConA in mice (n=10, )xsGroupDose /1mg kg Spleen lymphocyte proliferation(A570)Control groupSodium Chloride0.1430.04Low dose group500.1630.06Middle dose group10
24、00.2060.06High dose group2000.2630.10与对照组比较有统计学差异 P0.05 ,与对照组比较有显著性差异(P0.01) 。Compared with control group(P0.05/P0.01)1.3 统计处理数据均以均数标准差(XS)表示,采用单因素方差分析(ANOVA)和 t 检验采用 Statistica 6.0 对数据进行处理。P0.05 为有统计学意义,P0.01 为有显著性差异。2 讨论讨论据文献报道,有各种不同来源的多糖对机体的免疫功能都有不同程度的增强促进作用。多糖不仅能有效的激活免疫细胞、提高机体的免疫能力,而且对8正常宿主细胞没有直
25、接的毒副作用7。胸腺和脾脏是体内的主要免疫器官,与体液免疫和细胞免疫均有密切连续。脾脏以 B 淋巴细胞为主,而 B 淋巴细胞又是调节体液免疫的主要细胞。巨噬细胞参与机体的特异性和非特异性性免疫,具有强大的杀伤和清除作用,还能分泌细胞因子调节免疫,并将抗原提呈给 T、B 淋巴细胞89。本试验经过小鼠体内和体外两个方面考察毛蚶多糖(ASLP)对机体的免疫调节作用,证实毛蚶多糖(ASLP)能在体外单独增强小鼠淋巴细胞的增殖能力以及促进 IL-2 的产生,并且随着剂量的增加而增加;体内试验结果显示,毛蚶多糖(ASLP)对小鼠体重没有增强作用,但是高、中剂量的多糖对小鼠的胸腺指数和脾脏指数有比较明显的增
26、强作用(P0.05) ,这样排除了体重的影响,更能说明毛蚶多糖(ASLP)能增加胸腺和脾脏的净重量。并且毛蚶多糖(ASLP)能显著增强巨噬细胞的吞噬能力,提高机体对病原微生物的抵抗力,增强机体的非特异性免疫。同时还能增加 ConA 诱导的淋巴细胞增殖,大部分的体内免疫试验结果无剂量效应关系,其中中剂量的毛蚶多糖的结果较好,说明毛蚶多糖(ASLP)可能在体内有一个最适应效应量,大于这个剂量反而产生免疫抑制作用。因此,体内体外均表明毛蚶多糖(ASLP)能明显提高小鼠的免疫能力,有一定的免疫增强作用,可增强机体的特异性和非特异性免疫功能,是一种具有良好开发前景的免疫调节剂。参考文献:参考文献:1陈建
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