琼脂糖凝胶电泳检测dnappt课件.ppt
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1、琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA丁新伦丁新伦 13067206406【一】背景知识背景知识凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术;分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料: 琼脂糖琼脂糖电泳电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳【二二】实验目的实验目的n学习琼脂糖凝胶电泳分离学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法的原理和方法n检测碱裂解法提取质粒的结果检测碱裂解法提取质粒的结果n检测双酶切法鉴定重组质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果n检测检测PCR法鉴定重组质粒的结果法鉴定重组质粒的结果【三三】实验原理实验原理(1)某物质在电场作用
2、下的迁移速度叫做电泳)某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率,电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。的速率,电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快,紧分子质量越小跑得越快,紧密构型快于松散型开环分子或线性分子,从而可密构型快于松散型开环分子或线性分子,从而可以分离大小不同的以分离大小不同的DNA或或RNA分子。分子。(2 2)琼脂糖是一种)琼脂糖是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物,可以形成具有刚,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于性的滤孔,凝
3、胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度。浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。配制多大浓度的琼脂糖凝胶,要根据被检的配制多大浓度的琼脂糖凝胶,要根据被检的DNA分子大小来确定。分子大小来确定。(3 3)溴化乙锭为扁平状分子,在紫外光照射)溴化乙锭为扁平状分子,在紫外光照射下发射荧光。下发射荧光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复合物,其荧光强度与复合物,其荧光强度与DNADNA的含量成正比。的含量成正比。据此可判断据此可判断DNADNA分子量大小和粗略估计样品分子量大小和粗略估计样品DNADNA浓度。浓度。 琼脂糖是
4、一种线性多糖聚合物。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。【四】仪器、材料与试剂 质粒样品、酶切样品和质粒样品、酶切样品和PCRPCR样品。样品。 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统凝胶电泳系统和电泳图像分析系统( (凝胶成凝胶成像系统像系统) )等。等。 琼脂糖、琼脂糖、 1XTBE电泳缓冲液电泳缓冲液、溴化乙锭溴化乙锭、 6X载样缓冲液载样缓冲液 ( 6X loading buffer)和)和DNA分子量标准(分子量标准( Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker )等。)等。凝胶电泳系统凝胶电泳
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