分子实验设计.doc
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1、分子实验设计绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达张评瑜 2013141241157 田晓震 2013141241097绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿色荧光。 EGFP(Enhanced GFP)即增强型绿色荧光蛋白,它的 27k Da 的单体由 238 个氨基酸构成,本身就是一个生物发光系统,附带有激发后能发射生物荧光的发光色基。其发光过程不同于其它生物发光组织,是不需荧光素酶参与的。在紫外光激发下可发绿色荧光,常用作信号蛋白或报告基因。将目的基因与 E
2、GFP 基因插入载体重组表达后,可形成融合蛋白。通过荧光显微镜、共聚焦显微镜或紫外灯观察,可直接在活细胞中检测其荧光信号,简易方便地定性检测目的基因的表达,以及进一步研究目的蛋白的定位与动态过程。实验步骤:目的基因的获取基因表达载体的构建转化目的基因筛选与鉴定1、首先对所给的质粒进行转化,再在大肠杆菌中扩增培养。具体转化步骤见步骤三质粒 DNA 的提取及琼脂糖电泳检测1.1 质粒 DNA 的提取1.1.2 方法:碱裂解法1.1.3 原理: pEGFP-N3 质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达 EGFP 融合蛋白的质粒,它编码了 EGFP 蛋白,是野生型绿色荧光蛋白(wtGFP)经技术改造而成
3、的遗传突变体;pet 原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。 目的基因被克隆到 pET 质粒载体上,受噬菌体 T7 强转录及翻译信号控制;表达由宿主细胞提供的T7RNA 聚合酶诱导。宿主菌带有受 lacUV5 控制的 T7RNA 聚合酶基因,可以通过 IPTG 来启动表达。充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几小时,目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50以上。分离质粒 DNA 的方法一般包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增、收集和裂解细菌、分离和纯化质粒 DNA。50mmol/L 葡萄糖、10mmol/ EDTA-Na、25mmol/L Tris-HCl (pH8.
4、0) 分散细胞,其中螯合金属离子使酶失活,防止 DNA 的降解;0.4mol/L NaOH 和 2% SDS 临用前 1:1 配制,使细胞裂解,蛋白质与染色体 DNA 发生变性;60ml 5mol/L 醋酸钾、 11.5ml 冰醋酸 、28.5ml 双蒸水 使 DNA 在酸性条件下复性,留在上清液,大肠杆菌 DNA 和蛋白质-SDS 复合物等发生沉淀。 1.1.4 实验用品:1.1.4.1 仪器:恒温摇床,高压灭菌锅,超净工作台,10、100、1000L 微量移液器各一支,台式高速离心机,制冰机,混合漩涡器。1.1.4.2 材料:含质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3 菌液、.5ml 塑
5、料离心管、EP 管架、微量取液器和取液器吸头、常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、试剂瓶)等1.1.4.3 试剂:LB 培养液:胰蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeast extract)5 g,NaCl 5g,琼脂(固体培养基)15g,用 1N NaOH 调 pH 7.5。溶液 :50mmol/L 葡萄糖,10mmol/ EDTA-Na,25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) ;溶液 :0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,临用前1:1 配制;溶液 :5mol/L 醋酸钾 60ml,冰醋酸 11.5ml,双蒸水 28.5ml;卡纳霉素(50mg/mL);抽提液
6、(饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 ) ;无水乙醇;70%乙醇 ;TE 缓冲液或 ddH2O1.1.5 步骤:1.1.5.1 将含 pET- 28a 质粒的大肠杆菌,含 pEGFP-N3 质粒的大肠杆菌分别接种在液体培养基中(加卡那霉素 50g/mL) ,37培养过夜。1.1.5.2 取培养菌液 1.5mL 置 Eppendorf 小管中,10000rpm 离心2min,弃上清液。1.1.5.3 加入 100L 溶液 I,漩涡器上充分混匀,在室温下放置 10 min。1.1.5.4 加入 200L 新配制的溶液,轻轻翻转 23 次,使之混匀,冰上放置 5 min。 1.1.5.5 加入 1
7、50L 冰冷的溶液,盖紧后,温和颠倒 3-5 次使混匀,产生白色絮状物,冰上放置 15 min。 1.1.5.610000rpm 离心 5 min,取上清液于另一干净的离心管中。1.1.5.7 向上清液中加入等体积(约 400L)酚:氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v) ,振荡混匀,10000rpm 离心 10 min,将上清液转移至新的离心管中。 1.1.5.8 加入等体积(约 370L)氯仿/异戊醇(24:1) ,混匀,离心 2min ,取上清液于新离心管中。 1.1.5.9 向上清液加入 2 倍体积无水乙醇,混匀, -20放置 1h。1.1.5.10 12000rpm 离心 5 min
8、,倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 1.1.5.11 加 800L70%乙醇,12000rpm 离心 1 min,倒尽上清液,室温自然干燥 30min。 1.1.5.12 加 30L ddH2O ,-20保存备用。1.1.6 注意事项:)1.1.6.1 饱和酚(取下层)单独吸 200L,氯仿:异戊醇(24:1)吸 200L。1.1.6.2 制备质粒过程中,所有操作必须缓和,不要剧烈振荡(特别是加入溶液 II 和 III ) ,以避免机械剪切力对 DNA 的断裂作用。1.1.6.3 在取各种试剂的过程中,一定注意移液器吸头的更换,避免污染。1.2 琼脂糖电泳检测1.2.1 方法:琼
9、脂糖电泳1.2.2 原理:DNA 的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为 200bp 至近 50kb 的 DNA 分子。 DNA 的迁移率(U)的对数与凝胶浓度(T)之间存在反平行线性关系。因此,要有效地分离不同大小的DNA 片段,选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。在质粒提取的过程中,由于操作原因,提取的质粒可能有三种:线性 DNA、开环 DNA 、闭环超螺旋 DNA 。当提取的质粒 DNA 电泳时,同一质粒 DNA 泳动速度:闭环超螺旋线状开环。但有时也有也会出现相反情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。 1.2.3 实验用品:1.2.3.1 材料和仪器电泳仪,电泳槽,样
10、品槽模板(梳子) ,有机玻璃内槽,微波炉,水平仪,10、100、1000L 微量取液器各一支,凝胶成像系统,提取的 pET- 28a 和 pEGFP-N3 质粒,琼脂糖,锥形瓶,一次性手套,胶铲,封口膜,剪刀,取液器吸头。1.2.3.2 试剂Gold view(DNA 染料) ;0.5TBE 缓冲液:Tris 10.88g、硼酸5.52g、EDTANa22H2O 0.74g,定容至 200ml,使用时稀释 10 倍;6上样缓冲液:溴酚蓝 0.25、蔗糖 40%;DNA marker。1.2.4 步骤:1.2.4.1 琼脂糖凝胶板的制备 称取 0.3g 琼脂糖,置于锥形瓶中,加入 30mL0.5
11、TBE 缓冲液,微波炉加热直至琼脂糖溶解。待胶液冷却到 65(不烫手为宜) ,加入 1L Gold view 混匀,排除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽(插入样品槽模板梳子 )内 。静置 30min 左右,轻轻晃动拔出梳子。1.2.4.2 加样胶板放入电泳槽中(样品孔位于负极) ,注入 0.5TBE 缓冲液淹没过胶板 5mm,用取液器将提取的质粒 DNA5L 与 1L6上样缓冲液混匀,加入胶板的样品小槽内。1.2.4.3 电泳将电泳槽与电泳仪接通,调节电压为 100V 左右,直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约 12cm 处,停止电泳。 1.2.4.4 观察和拍照将胶板小心取出,放
12、入凝胶成像系统中,调节位置居中,波长为 254nm 的紫外灯下,观察凝胶中 DNA 存在处显示出荧光条带。1.2.5 实验结果预测:正常情况下会出现两条条带(闭环和开环质粒) 。2、基因表达载体的构建1、DNA 限制性内切酶酶切1.1 方法:DNA 限制性酶切1.2 原理:生物体内能识别并切割特异的双链 DNA 序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用是在 DNA 分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶)。pet 原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。 目的基因被克隆到 pET 质粒载体上,受噬菌体 T7 强转录及翻译信号控制;表达由宿主细胞提供的 T7RNA 聚合酶诱导。宿主菌带有受
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