2002 international practical-3.doc
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1、第十三屆國際生物奧林匹亞競賽里加 拉拖維亞July 7-13,2002實驗部分實驗三:分子生物學本實作測驗時間為60分鐘:佔40分工作目標:利用洋菜凝膠電泳分離質體pX的DNA片段,並建構出質體pX的限制酶圖譜(輿圖)對於嚴格遵守實驗室安全操作手則,以及能精確地把樣本放入凝膠的同學,助教將給予5分:A- 於整個實驗進行過程中,穿戴實驗手套1分B- 使用電源供應器前,先徵詢助教,以及正確地使用紫外線照明燈1分C- 正確地使用微量滴管1分D- 把全部數量的樣本,放入電泳膠孔槽中1分E- 不要損壞電泳凝膠1分注意:每三四位同學使用一台電源供應器,每二位同學使用一台紫外線照射燈請於整個實驗進行過程中,
2、穿戴實驗手套助教有管理電源供應器的優先權實驗技術解說:原理電泳是一種被廣泛使用的分析方法,可根據分子的電荷、分子量及體積,分離不同的分子。電泳分離最常進行於凝膠中,在凝膠中有相似電荷的分子,可根據其分子量及體積予以分離,用以形成凝膠的物質,被溶解於緩衝液溶液中質體DNA圖譜的製作質體是環狀,位於染體外的雙股DNA分子,在多種不同的細菌中均可發現,限制酶是一群核酸切割酵素,可於特定的部位切割DNA分子【特定的46個核甘酸(鹼基對)】,例如稱為HaeIII的限制酶,會於GGCC的序列處切割雙股DNA,但稱為EcoRI的限制酶,則會於GAATTC序列處切割雙股DNA。質體DNA圖譜的製作,是標定出質
3、體DNA分子上各限制酶切割位的相對位置,為達成此項目的,我們必需決定出,利用不同的限制酶所切割出的DNA片段的長度,質體分子可被一種或同時被多種限制酶所切割,被切割出來的DNA片段,會於電泳的過程中移動並形成多條集中的帶,利用特殊的染料對電泳凝膠進行染色後,便可在凝膠上觀察這些由DNA片段所形成的色帶。電泳過程中,DNA片段在凝膠中移動的距離(自電泳開始時的位置算起,一直到帶的前緣,以公分為單位),與DNA片段的鹼基對長度呈現對數的反比關係。洋菜凝膠是最常用於製作電泳凝膠的物質之一,洋菜凝膠中的孔洞,足以分離分子量大於100000(道耳頓)(Da)。實驗設備洋菜凝膠電泳槽【(圖1)4】包括兩個
4、電極,分別為陽極(5)及陰極(6),於電泳進行前,凝膠被放置於緩衝溶液中(7),包括需要被分析的樣本混合物裝填入凝膠孔槽中(1),凝膠孔槽是於凝膠載槽(3)上製備凝膠時(2),用孔槽梳(comb)所製造而成,電泳槽蓋上蓋子後(8),再連接到電源供應器上。圖1 電泳槽及一塊電泳凝膠可調整體積的微量滴管,用於液體試劑的操作(圖2)圖2 可調整體積的微量滴管微量滴管的使用:1. 經由轉動調節輪(3)控制所選取的量(2)!本實驗中你需要取用5l和10l的量。圖3為取用5l和10l時面板的正確顯示。圖3 吸取5ml和10ml時微量吸管控制面板的正確顯示2. 將黃色微量吸頭放在微量吸管前,請不要在未放ti
5、p之前沾取液體。3. 將按紐輕壓到第1階段,吸頭浸入液體(樣本)。 (圖4A)4. 慢慢放開按紐吸取適量標本。(圖4B)5. 將吸頭處的液體帶入目標處(其它液體或洋菜膠片的凹槽中),然後壓下按紐,將液體全部釋出。(圖4C)用手將微量吸頭取下圖4 取用液體的步驟6. 取下微量吸管的吸頭(用手)(圖4D),並將用過的微量吸頭丟置到垃圾桶。每一個液體或取樣時用一個新的微量吸頭!在真正取用DNA樣本前,你可以試用1個微量吸頭吸取杯中的緩衝液,作數次的練習。試劑和材料1. 製備好的0.8洋菜凝膠,放置於0.5 TAE緩衝液中2. 電泳裝置,內含0.5 TAE緩衝液(20mM Tris-醋酸,0.5mM
6、EDTA,pH=8.0)3. 2 X GLB-gel loading緩衝液,內含0.05 bromophenol blue於10%甘油。4. StDNA長度標準液,事先已和loading buffer混合均勻(以下有更詳盡說明)5. BC和BD質體pXDNA5l,分別被限制酶BC和BD處理(詳細說明見Q2的說明)DNA樣本已加入1:10000比例的瑩光染料(Vistra Green)所有使用的質體pX的長度為4360個鹽基對。實驗(第一階段)樣品裝填1. (如圖5)在膠片的No.2和No.5兩孔槽中各裝填10l的DNA長度標準液(St)2. 在每個切過的質體DNA樣本中加入5l的2 X GLB
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