最新受体分析检查-检验核医学PPT课件.ppt
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1、2v受体受体(receptor)是细胞膜上或细胞内的一些能与生物活性物质相互作用相互作用并引起特异性生引起特异性生物效应物效应的物质。v受体与其配体配体(ligand)结合后,通过受体特定的信号传导系统,引起细胞的特定反应,是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分子。9v2 2、核受体、核受体 v受体在细胞核上,通过与细胞核内特定的DNA结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是由4001,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质。氨基端是高度可变区氨基端是高度可变区,与转录的特异性有关。中间是中间是DNADNA结合区结合区,富含半胱氨酸,含有两个“锌指”结构,受体通过“锌指”与DNA结
2、合;该区域部位保守性强。羧基羧基端为激素结合区端为激素结合区。 v糖皮质激素受体类、性激素受体类、甲状腺激素受体类。10三、受体与其配基作用的特点三、受体与其配基作用的特点v1可饱和性v2可逆性v3、特异性和亲和力v4生物效应的一致性 v5. 需具有内源性配体 11v1 1可饱和性可饱和性v每个细胞所含的受体数目有限,故配体与受体的结合反应具有可饱和性,呈高亲和力和低容量。v2 2、可逆性、可逆性v配体与受体的结合是可逆的,当受体周围配体浓度降低,结合反应就逆向进行,即配体与受体解离,解离后的配体是原形,不起代谢变化。12v3、特异性特异性和亲和力亲和力v受体有特异识别配体的作用,只有严格构型
3、和构象的配体才能选择性地与某受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织的专一性。受体的亲和力表明其与配体的结合能力,高亲和力说明受体配体结合牢固。平衡解离常数在10-9mol/L以上的被认为高亲和力受体。13v4生物效应的一致性生物效应的一致性v受体的主要功能是介导配体的生物效应,如一种蛋白质与某种物质结合而不介导特定生物效应,则此蛋白质不能称之为受体。v5. 5. 需具有内源性配体需具有内源性配体v受体都需有内源性配体,如果通过外源性配体发现某种蛋白质分子具有类似受体的特性,但未找到内源性配体,则称之为孤儿受体,不能认为是真正的受体。14四、单位点系统四、单位点系统RBA的基本原理的基本原理v
4、1 1、简单单位点系统受体配体相互作用的基、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律本规律v 不少受体与配体结合的系统只存在一种结合位点,即简单单位点系统,其基本规律符合质量作用定律质量作用定律。质量作用定律质量作用定律15 1=1RL, 2=2RL平衡时:平衡时:1RL= 2RL则平衡解离常数:则平衡解离常数: KD=2/1=R.L/RL KD是平衡解离常数是平衡解离常数,为平衡亲和常数为平衡亲和常数KA的的倒数,单位为倒数,单位为mol/L,KD越大表示亲和越大表示亲和力越低。力越低。 16设 受 体 和 配 体 的 初 始 浓 度 为设 受 体 和 配 体 的 初 始 浓 度 为 R T
5、 和和LT,R=RT-RL,L=LT-RL,则:,则:v经整理后得:经整理后得:v RL2 RLRT + LT + KD + RTLT= 0 对特定配体和某一固定量的特定受体,对特定配体和某一固定量的特定受体,RT和和KD均是定值,于是均是定值,于是RL仅随仅随LT而变,而变,二者呈双曲线函数关系。二者呈双曲线函数关系。 RLRLLTRLRTRLLRLRTKD17v2 2、饱和曲线、饱和曲线v简单单位点系统简单单位点系统RBA应能得到典型的饱和曲应能得到典型的饱和曲线。以线。以RL为纵坐标,为纵坐标,LT为横坐标,得到为横坐标,得到RL随随LT变化的曲线。配体的浓度从零开变化的曲线。配体的浓度
6、从零开始上升时,复合物浓度先是上升很快,以后始上升时,复合物浓度先是上升很快,以后逐渐变慢,最后绝大部分受体都与配体结合,逐渐变慢,最后绝大部分受体都与配体结合,即受体饱和了。此就是即受体饱和了。此就是饱和曲线。饱和曲线。v饱和曲线趋向水平则说明饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配大部分受体已与配体结合体结合。1819(1)总结合)总结合(total binding,TB)v受体与标记配体结合时,测量得到的放受体与标记配体结合时,测量得到的放射性还含有一部分(反应管壁吸附、杂射性还含有一部分(反应管壁吸附、杂蛋白吸附、分离不完全等)未与受体结蛋白吸附、分离不完全等)未与受体结合的标记配体的放
7、射性,需将此部分减合的标记配体的放射性,需将此部分减去才能得到特异结合计数。去才能得到特异结合计数。20(2)非特异结合)非特异结合(non-specific binding,NSB)v放射性配体除与受体特异性结合外,尚可与其他成放射性配体除与受体特异性结合外,尚可与其他成分结合,称之为分结合,称之为NSB。主要来自杂蛋白、反应器壁、。主要来自杂蛋白、反应器壁、分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力小,分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力小,不会出现饱和现象,结合量与所使用的配体量呈线不会出现饱和现象,结合量与所使用的配体量呈线性关系。性关系。v常做一系列平行管,条件与常做一系列平行
8、管,条件与TB相同,多加相同,多加200 1000倍非标记配体以取代标记配体与受体结合,测倍非标记配体以取代标记配体与受体结合,测得的即得的即NSB。 21(3)特异结合)特异结合(specific binding,SB)v受体与标记配体结合的放射性计数,无法直受体与标记配体结合的放射性计数,无法直接获得。常用相同浓度的接获得。常用相同浓度的TB减去减去NSB求得。求得。22TBSBNSB23五、离体五、离体RBA的基本方法的基本方法 制备待测受体的离体标本制备待测受体的离体标本加放射性配体温育一定时间加放射性配体温育一定时间终止反应、分离结合与游离部分终止反应、分离结合与游离部分测定结合部分
9、的放射性测定结合部分的放射性数据处理、求出有关参数数据处理、求出有关参数24(一)基本试剂及制备(一)基本试剂及制备v1、受体样本、受体样本v2、放射标记配基、放射标记配基v3、非标记配基、非标记配基251、待测受体标本的制备、待测受体标本的制备 v用于离体用于离体RBA的标本大体可分为组的标本大体可分为组织切片、完整细胞悬液、经初步分织切片、完整细胞悬液、经初步分离的细胞组分及经增溶或进一步纯离的细胞组分及经增溶或进一步纯化的受体蛋白等。化的受体蛋白等。26v1)组织切片)组织切片v为保持受体活性,常用冷冻组织切片,厚度550 m,将其贴于涂有明胶的玻片上,在温育缓冲液中与标记配体进行反应。
10、反应后洗去游离部分。可刮下切片测量其放射性活度,也可用放射自显影或免疫组化研究受体分布。27v2)完整细胞悬液的制备)完整细胞悬液的制备v血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。 从从组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织,再将游组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织,再将游离的细胞分离出来。离的细胞分离出来。v用完整细胞进行用完整细胞进行RBA的的主要优点主要优点是可同时观察配体是可同时观察配体与受体结合的情况与受体结合的情况和和细胞的生物效应细胞的生物效应,得到的结果,得到的结果更能反映受体的生理特性。此外,还可更能反映受体的生理特性。此外,还可直接
11、给出直接给出平平均每个细胞的均每个细胞的受体数目受体数目。缺点是在处理过程中有时。缺点是在处理过程中有时可能导致细胞表面生理活性的改变。有时受体在细可能导致细胞表面生理活性的改变。有时受体在细胞中的含量很低,则需用较大量的细胞才能作一次胞中的含量很低,则需用较大量的细胞才能作一次实验。实验。28v3)细胞组分的分离)细胞组分的分离v组织匀浆多数RBA使用细胞组分进行分析。其优点是:去除了大部分杂蛋白和内源性配体,减少NSB或其他因素的干扰;受体蛋白得到初步浓缩,受体制剂的富集可获得可靠的实验结果。29组织匀浆组织匀浆沉淀:完整细沉淀:完整细胞、核受体胞、核受体上清液上清液8003500g, 1
12、015 min沉淀:线粒沉淀:线粒体,膜受体体,膜受体上清液上清液10,000300,000g, 1015 min沉淀:微沉淀:微粒体粒体上清液:上清液:浆受体浆受体10,000300,000g, 1015 min302、放射标记配基、放射标记配基1 1)高亲和力、高特异性)高亲和力、高特异性2 2)高稳定性)高稳定性3 3)高比活度)高比活度4 4)高放化纯)高放化纯313 3、非标记配基、非标记配基v用来设立用来设立NSB,可以与标记配基同一物质,可以与标记配基同一物质,也可不同,但必须与受体结合有高亲和力。也可不同,但必须与受体结合有高亲和力。32(二)温育条件(二)温育条件v1、缓冲液
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