临床基因治疗及其载体的研究进展.pdf
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1、临床基因治疗及其载体的研究进展高越张敬之【摘要】 自1989实施年第一例f临床基因治疗实验以来,全球有超过1900例基因治疗方案正在进行或已经完成。人类基因治疗在治疗癌症、遗传病、心血管病等各类疾病中取得了长足的进步,同时也遇到了一些困难。需要既有效且无毒副作用的基因导入和稳定表达系统。目前基因治疗常使用病毒和非病毒载体,其中,病毒载体在临床基因治疗过程中得到更广泛地使用。文中总结了一些重要的临床基因治疗的病例,并对其相应的基因导入系统作一综述。【关键词】 临床实验; 基因治疗; 病毒载体; 非病毒载体Progress of gene therapy in clinical trials wi
2、th the appHcafion of the vectorsYne,砒昭Jingzhi(Shanghai Institute of Medical Genetics,ChildrenS Hospital of Shanghai,Childrens Hospital Affiliatedto Shanghai j汹Tong Unwem秒。酗Laboratory of Embryo Molecular Biology,Min妇try of HealthShanghai Key Laboratory of Embryo and Reproduction Engineering,Shanghai
3、200040,China)co唧。枷喈author:Zhang五,咖iEmail:#hang 38hotmailcom【Abstract】 Since the first clinical trial of human gene therapy in 1 989,over 1 900 trials havebeen conducted worldwideHuman gene therapy has been made substantial progress on treating cancers,inherited monogenic disorders and cardiovascular
4、 disease,ec,while,encountered with hurdles simultaneouslyAmong them,a major impediment to the SUCCESS of gene therapy application is an efficient and noside-effect gene delivery systemAmong the viral and non-viral vectors that were often used in clinical trials,viral vectors have been preferably cho
5、senIn this article,some of the important clinical印plieations诵th the choice of the vectors are reviewed【Key words】 Clinical trial; Gene therapy; Viral vector; Nonviral vector基因治疗是指将外源功能基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,从而达到治疗的目的。因其主要通过靶细胞来实现治疗效果,所以也常被称为基因与细胞治疗。自1 989年Rosenberg等利用1逆转录病毒载体实施第一例人类基因治疗实验以DOI:1
6、03760cmaJissn1673-4386201401006基金项目:国家自然科学基金(81271690);国家重大基础研究发展计划(973计划)(2010CB945202)作者单位:200040,上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室通信作者:张敬之(Email:jzhan938hotrnailcom)29综述来,全球有超过33个国家的1900多例临床基因治疗方案正在进行或已经完成。近些年来,每年约100例新增临床基因治疗的案例实施。目前,基因治疗主要是针对那些对人类健康威胁严重的疾病,如恶性肿瘤、
7、单基因遗传病、心血管疾病、神经系统疾病、感染性疾病等。基因治疗成功的关键在于安全高效地将遗传物质传递到靶细胞,而外源基因的导入效率直接影响基因在体内的表达水平。目前,基因治疗使用的载体主要分为非病毒载体和病毒载体。非病毒载体主要有裸DNA、脂质体、阳离子聚合物等,其特点是毒性小、安全性高、外源万方数据基因长度不受限制。病毒载体是基因治疗中应用较多的载体,主要有逆转录病毒载体(包括1逆转录病毒载体和慢病毒载体等)、腺病毒载体、腺相关病毒载体等,病毒载体的主要优点是具有有效进入细胞并且表达外源基因的能力。随着科学技术的发展,许多载体经过改造后已经应用到临床基因治疗中,文中就目前临床基因治疗的病例及
8、其使用较多的载体的种类、特点等作一综述。1 临床基因治疗使用的载体11 逆转录病毒载体逆转录病毒(retrovirus,Rv)是单链RNA病毒,可高效地感染许多类型的宿主细胞,稳定地整合到宿主细胞基因组中并持续表达。其中,y逆转录病毒载体(一般由小鼠白血病病毒MLV改造而来)是最早被改造的且最广泛地被应用到基因治疗当中。1990年,Blaese等心1用1逆转录病毒载体来表达腺苷脱氨酶(adenosinedeaminase,ADA)基因,该载体被命名为LASN,用于治疗两例重症联合免疫缺陷(ADA severecombined immunodeficiency,ADASCID)的儿童患者。通过收
9、集患者外周血中的T细胞,导入LASN载体并在培养基中体外增殖9到1 2天后,将转导后的T细胞重新输入患者体内【3】,使接受治疗后的患者机体产生ADA的能力有所提高。而Aiuti等H刮给1 0名ADASCID患者注入1逆转录病毒载体转导的CD34+骨髓造血干细胞,其中8人基本得到治愈,ADA基因在淋巴细胞和红细胞中长期稳定表达,患者获得了系统的解毒作用,免疫功能也得到了修复。在全球范围内展开的其他针对ADASCID患者的基因治疗也达到了良好的效果【67 J。2006年,Morgan等旧1通过使用1逆转录病毒载体表达T细胞受体,从而产生能够特异识别肿瘤的淋巴细胞,将这些细胞转移到15名黑色素瘤(m
10、elanoma)患者体内,注入后患者外周血淋巴细胞在超过2个月的时间里均有超过10的移植成活率,其中两名患者体内特异识别肿瘤的细胞可稳定循环流通长达1年。并且黑色素瘤病变发生退化。在阿尔茨海默病(ALzlleimerdisease)、多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)、艾滋病(AIDS)、慢性肉芽肿(chronicgranulomatous disease)等疾病的临床实验中,1逆转录病毒载体也得到了广泛的应用9d 21。虽然y逆转录病毒载体在基因治疗上展现出巨大的潜力,但也存在着一些不足。如不能感染非分裂细胞;转录终止能力相对较弱。从而有可能造成转录通读;可
11、能产生有复制能力的病毒;可能造成插入性突变;包装外源基因的能力有限(一般在7 kb以下)等。自2002年以来,HaeeinBey-Abina等【13141使用1逆转录病毒载体治疗的10例x连锁重度复合型免疫缺陷病(XSCID)患者中,已有4例因载体整合在原癌基因LM02等的附近,激活下游基因的表达而罹患白血病。Y逆转录病毒的插入位点是随机的,但更偏向于插入基因的第一个内含子和转录起始位点5|。人们开始重新审视基因治疗载体的使用所带来的风险,特别是使用Y逆转录病毒载体。美国食品药品管理局(FDA)提出在XSCID的临床基因治疗中可以使用1逆转录病毒载体,但必须符合以下条件:先前造血干细胞或骨髓移
12、植治疗失败,或者没有其他可选择的治疗方法。受到临床基因治疗不良事件的影响,目前逆转录病毒载体在基因治疗中的使用比例为1 9(2004年为28)。为了改善逆转录病毒基因治疗中可能出现的风险问题,科学家不断研究并提出了定向感染、局部注入、定点插入、使用细胞特异性启动子与增强子、自灭活设计、共表达自杀基因等措施,来提高逆转录病毒载体的有效性和安全性。12慢病毒载体慢病毒(1entivirus,LV)属于逆转录病毒科慢病毒属,包括I型人免疫缺陷病毒(humanimmunode6ciency virus 1,HIV一1)、猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,FIV
13、)、猿免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)和牛免疫缺陷病毒(bovine immunodeficiency virus,万方数据垦匾遣佳堂盘查!生!旦!i旦笠!鲞箜!塑!堕堡!堕里业:!i:!:!:!:盟!:!BIV)等。慢病毒载体与以往的1逆转录病毒载体不同,它能同时感染分裂和非分裂细胞,而且比腺病毒载体的免疫反应小,其转移基因片段容量比较大,并能长期稳定地表达。由于最初研发的慢病毒载体来源于HIV一1,其生物安全性也倍受关注。慢病毒载体的改造包括删除野生型HIV1的辅助蛋白以及功能性删减长末端重复序列,使用三质粒或多质粒系统(包装质粒,包膜质粒
14、以及病毒转移载体等)。这些调整使得慢病毒载体不易发生同源重组,不易产生具有复制能力的重组活病毒。慢病毒载体第一次应用于临床是用来治疗艾滋病6|。富集5名患者外周血CD4+T淋巴细胞,转导HIV1来源的慢病毒载体VRX-496,通过静脉注人患者体内。VRX496载体来源于NL43野生型HIV一1,携带并表达一个937 bp的靶向HIV一1包膜基因的反义核酸。VRX496载体使用水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)糖蛋白G包膜蛋白取代HIV一1本身的包膜蛋白,从而扩大了HIV载体的嗜性范围,并且赋予HIV载体颗粒高度的稳定性川。治疗后,其中4人的CD4+T
15、细胞数保持稳定或上升;5人对HIV一1抗原的免疫能力升高,而且经过21到36个月观察,没有插人性突变现象的发生。然而在治疗1例B地中海贫血患者过程中,优势克隆的出现则引起了人们的重视。CavazzanaCalvo等副用携带正常人8珠蛋白基因的慢病毒载体治疗1例重症13EB0-地中海贫血患者,接受治疗的患者已经有21个月可以不靠输血来维持自身血液中的血红蛋白浓度。血红蛋白中有13来自于慢病毒载体的表达,其中大部分的治疗效果源于一个优势细胞克隆。在优势克隆中整合入的载体引起了HMGA2基因的转录激活,但并没有引起不良反应以及血液系统异常,意味着这是一个良性克隆9|。在基因治疗6年后,该细胞克隆已经
16、不再占优势,但仍能表达足够量的经过修正的B一珠蛋白。2006年,Cartier等埘1用携带野生型ABCDl基因的自灭活慢病毒载体对两例X连锁的肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy,ALD)患者进行基因治疗。经过2430个月的跟踪研究,检测到多个细胞克隆,包含9一14的粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞表达ALD蛋白。注入基因修复细胞后的1416个月,2例患者的大脑脱髓鞘进程中止,临床治疗结果类似于异源造血干细胞移植。因此,慢病毒载体介导的同体造血干细胞基因治疗可以为ALD临床治疗带来裨益,这也是第一例报道的慢病毒载体可成功地用于治疗人类遗传疾病。随后,Biffi
17、等嵋引报道了对3名罹患异染性脑白质营养不良(metachromaticleukodystrophy,MLD)的溶酶体贮积病的患者的分析,通过慢病毒载体将有功能的芳基硫酸酯酶A(arylsulfatase A,ARSA)基因插入到患者的HSCs,重新注入患者体内后不久便稳定表达ARSA酶。在一个患者接受治疗后2年以及另外两个患者接受治疗18个月后,该疾病的发展过程停止,并且没有异常克隆的出现。奥尔德利希综合征(WiskottAldrich syn-drome,WAS)是一种严重的伴X染色体原发性免疫缺陷症,是由编码WAS蛋白(WASp)的单基因突变造成的,可通过同种异体造血干细胞移植来治疗。在最
18、初的I期临床基因治疗中,Boztug等旧纠利用表达WASp的重组1逆转录病毒载体转导患者自体CD34+造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs),然后回输到患者体内,患者细胞功能以及免疫学机制得到修复,证明了在WAS患者造血干细胞中导人功能基因的策略是可行的。然而随后发现其中一名患者由于载体插入原癌基因LM02附近而患上T细胞白血病。科学家们开始寻求其他的方法,使用了HIV一1来源的重组慢病毒载体J。与1逆转录病毒载体相比,慢病毒载体有许多优点:它的感染不依赖于细胞分裂,从而减少了细胞培养时间,保证了转导过程造血干细胞的活力;通过自灭活设计可减少整合载体对附万方数
19、据国匿逞篮堂盘查!Q!生!旦!i旦箜!鲞筮!塑!坐鱼!堕里尘:!i:!Q!:y!:!:盟!:!近基因表达的干扰;使用WAS内源临近启动子来表达全长WAS eDNA。其良好的临床前实验结果也支持了数个使用慢病毒载体治疗WAS的I临床治疗。目前,在伦敦、巴黎、波士顿以及米兰等地均有此类临床研究25。其中,Aiuti等m o在米兰进行l临床洽疗的最新研究表明,使用慢病毒载体在3个患有WiskottAldrich综合征的儿童中能成功地替换了其WAS基因。研究人员同样使用慢病毒载体将功能性WAS基因导人患者HSCs后,这些患者的免疫系统重新接受了这些经纠错的细胞。在基因治疗后的2032周内,该病产生的复
20、发性感染和湿疹等症状有所减轻或者全部消失。这些结果表明慢病毒载体在基因治疗过程中可能比传统的1逆转录病毒载体更安全。近年来,使用慢病毒载体进行治疗所取得的成功,展现出慢病毒载体的一些优越性,并继续为基因治疗的发展铺平道路。13腺病毒载体腺病毒(adenovirus,AdV)是无包膜的线性双链DNA病毒,在自然界分布广泛,目前应用的腺病毒载体主要是在2型(Ad2)或5型(Ad5)的基础上构建的。腺病毒载体是目前临床基因治疗中使用最多的载体,占所有使用的基因治疗载体的24。腺病毒载体宿主细胞范围广泛,既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞,容易制备高滴度病毒颗粒,在宿主细胞内不发生整合,因而没有插
21、入突变的风险,载体容量较大。然而,它缺乏特异靶向性,在一些缺乏其相应受体的细胞中感染效率低。因其不能整合人宿主染色体上,所以目的基因的表达时间也较短,可能需要重复给予载体制剂进行治疗。在体内应用时产生的免疫反应也限制了它的应用。临床基因治疗中发生的第一个严重的不良事件是1 8岁的鸟氨酸转氨甲酰酶(omithine transcarbamylase,OTC)缺陷患者Jesse Gelsinger在接受重组腺病毒载体基因治疗过程中死亡,原因是在肝动脉注射给药数小时后出现了严重的炎症反应【2 7|。这使研究者们对腺病毒载体的应用更为谨慎。科学家对腺病毒载体的改造经历了多个阶段,逐渐产生了第一代腺病毒
22、载体:删除E1(病毒复制必须区)和E3(病毒复制非必须区)区以便插入目的基因,产生复制缺陷型重组腺病毒载体;第二代腺病毒载体:在E1、E3缺失的基础上进一步去除了E4(有效调节晚期基因转录)区;第三代腺病毒载体缺失了除了末端重复序列和包装信号序列以外的所有病毒基因,有效地降低了机体的免疫反应,使治疗基因的表达持续时间延长,同时也提高了载体包装长插入子的能力。Lang等旧副通过瘤内注射Adp53开展了治疗恶性神经胶质瘤的I期临床实验。Adp53是基于5型复制缺陷型腺病毒载体构建的,其中,E1区被巨细胞病毒启动子(cytomegaoviyns,CMV)驱动的野生型p53基因的eDNA所取代。临床实
23、验采用了两阶段手术方法,在所有1 5名患者的星状瘤细胞核内均检测到外源P53蛋白,1名患者在瘤切除后超过3年没有复发,4名患者在治疗后超过6个月没有复发,其中2人超过1年。同时,注入的P53临床毒性很小并且没有达到最大耐受剂量。为了提高腺病毒载体的靶向性,科学家们使用了一种条件性复制型腺病毒载体ONYX一015,通过瘤内注射的方法治疗恶性胶质瘤旧J、头颈部肿瘤驯以及肝胆肿瘤u等肿瘤疾病。ONYX一01 5删除了E1 B55Kd DNA片段。理论上,ONYX一01 5在正常细胞中不发生复制,但可在p53缺陷肿瘤细胞中选择性复制,实现溶瘤作用,表现出一定的靶向抗癌活性。但病毒中的E1 A蛋白仍可能
24、会造成一些正常细胞的早期凋亡。在我国使用rAd-p53治疗头颈部鳞状细胞癌的临床治疗过程中旧2I,重组人腺病毒p53注射剂(商标为“今又生”)经中国国家食品药品监督管理局批准,成为世界上首例经国家政府机关批准用于治疗癌症适应症的基因治疗产品。“今又生”使用人血清型5重组腺病毒载体,E1区被人野生型p53表达框替代,并由鲁万方数据国匠遗佳堂苤查!兰生!旦!i旦筮!鲞筮!翅!坐鱼!堕里尘:!i:!Q!垒,Y丛:!:盟!:!斯氏肉瘤病毒(rolls sarcoma rims,RSV)启动子驱动并包含一个牛生长激素(bovine g砌礼hor-mone,BGH)Poly(A)尾。“今又生”由有治疗作用
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- 临床 基因治疗 及其 载体 研究进展
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