后发性白内障基因治疗的研究进展.pdf
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1、引文格式:董敏,康刚劲 。 。、。、。t1。、ij“:。t、?()。、。【。1儿、。、。!后发性白内障基因治疗的研究进展J眼科新进展,2013,33(10):997-1000: 、一:。、?c、。L?。o。I|。I)t。o。o。?。t】、u“。1。:”。:后发性白内障基因治疗的研究进展董敏康刚劲【文献综述】:拓茹弄薹磊,;,:,篙。军、i葺菖。:The research progress of gene therapy in;Aimut DONG Min:Femalebom in:【Key words】posterior capsule opacification;suicide gene;g
2、ene therapy;bax gene;:January,1987Master degreeTel:?antisense c-myc gene;RNAi1 13608289281;E-mail:615799919+【Abstract】Posterior capsule opacification(PC0)is the most common postopera-:qq“ tive complication for cataract surgeryand it is also the main cause for decreased vision:收稿日期:20121l-02 :of cata
3、ract patients after operationAt present,there is no safe drug treatment for PCo,:修回日期:2013-02-07 although Nd:YAG laser is effective,there are some complicationsWith the development灞纂黧裂紫一of molecularb ogythe prevention粤etreatmenthof PC。b翟e器ctherampynewway This paper gwes a rewew of th researc progres
4、s ee to e茹SUl:g=!泸州医学院附属医院眼科 ? e n splc me clcIe e1e!通讯作者:康刚劲,Email:kang:therapy and gene interference treatment of PC0:gangiinyahoocn :Rec Adv Ophthalmoi,2013,33(10):997-1000Received date:Nov 2,2012 i:怒掣寒=篇苫曙刍fhf。fo:【关键词】后发性白内障;自杀基因;基因治疗;bax基因;反义cmyc基因;RNAii gy,the Affiliated Hospital of Luzhou:【摘要
5、】 后发性白内障是白内障术后最常见的并发症,亦是白内障患者术后视力下降的i Medical College,Luzhou 646000,Si一:主要原因。目前尚无安全的药物治疗方法,Nd:YAG激光虽然有效,但存在一定的并发症。;瓮篡:竺溢鼍I:罴KANG G。i随着岔子生誓兰紫不孽发展,墨因治疗穆后发譬皇皂孳的防治开辟了一条新途径。本文i Ji。汪。il:kangga。鲥j。vahoo。对后发性白内障自杀基因和基因干扰治疗的研究进展作一综述。一一一一;眼科新进展,2013,33(10):9971000后发性白内障(posterior capsule opacification,PCO)是目前
6、白内障术后导致视力下降的最主要并发症。据统计,在成人白内障术后3 a,PCO发生率为3050,婴幼儿白内障术后PCO发生率可达到1001 2-3 3。激光后囊切开术即Nd:YAG激光晶状体后囊膜切开术是目前治疗PCO最常用的方法。Nd:YAG激光具有光爆破击穿作用,可切割或破碎组织,Nd:YAG激光囊膜切开术可在不切开眼球的情况下,用激光切开眼内组织,是当今最安全的囊膜切开术,也是治疗各种原因所致后囊膜混浊行之有效的途径。但该术式易造成人工晶状体损伤,术后常出现眼压升高、视网膜脱离和黄斑囊样水肿等并发症H J。目前PCO无安全的药物治疗方法,PCO的治疗药物大多包括细胞毒性药物、凋亡诱导与芒!
7、气47皂气L百芒4ie气L雷吐i4气#弋L;皂弋L冒。马芒1!与4苷吐气L写4i皂弋L可4i皂弋L54id气L可芒I屯4彳皂气FLq芒i41i吐气L写4“ie弋L口芒!气did弋I;p27 Huang W,砌eta J,Gno Y,Grosskreutz CLDownregulation ofThyl in retinal gan班on cells in experimental glaucomaJCurtEyeRes,2006,3l(3):26527128 Weishaupt JH,K15cker N,Biihr MAxotomyinduced earlydownregulation of
8、POUIV class transcription factors Bm一3aand Bm-3b in retinal ganglion ceilsf J 1J Mol Neurosci,200526(1):172529 Soto I,Oglesby E,Buckinghair BP,Son JL,Roberson EDSteeleMR,et a1Retinal ganglion cells downregulate gene expressionand lose their axons within the optic nerve head in a mousemaucomamodelJIJ
9、Neurosci,200828(2):548-56130 Pelzel HRSehlamp CLNiekells RWHistone H4 deacetylationplays a critical role in early gene silencing during neuronal ap-optosisf J fI珏形Neurosci,20101l:623l Libby RT,U Y,Savinova OV,Balter J,Smith RS,Nickells RW甜aSusceptibility to neurode-generation in a glaucoma is modifl
10、ed byBax gene dosageJPLDsGenet,2005,l(1):172632 Pelzel HR,schiamp CL,Waclawski MShaw MKNickells RWSilencing of Fernl cR3 gene expression in me DBA2J mooseprecedes re廿nal ganglion cell death and is associated with his-tone deacetylase activityJInvest Ophthazmol Vis Sc,201 253(3):1428一123533 Biermann
11、J,Boyle J,Pielen A,La辨ze WAHistone deaeetylaseinhibitors sodilllll butyrate and valproic acid delay spontaneooscell death in purified rat retinal ganglion cellsJM01,201117:39540334 Biermann J,Grieshaber P,Goebel U,Martin G,Thanos SDiGiovanni Set a1Valproic acidmediated neuroprotection andregeneratio
12、n in iaiured retinal ganglion cellsJInvest Oph-tham01Sc,20lO5l(1):52653435 Crosson CE,Mani SK,Husain S,Alsarraf OMenick DRInhibi1ion of historic deacetylase protects the retina from ischemic injuryJInvest OphOwdm01Sc,2010,5l(7):3639364536 Fan G,Beard C,Chen RZ,Csankovszki G,Sun YSiniala M,et以DNA hyp
13、omethylation perturbs the function and survival ofCNS neuronsinpostnatal animalsJJNeurosci,2001,2l(3):78879737 Nguyen S,Meletis K,Fu D,J11averi S。Jaeniseh RAblation of denovo DNA methyltransferase Dnmt3a in the nervous systemleads to neuromuscular defects and shortened lifespanJDevDyn,2007236(6):166
14、3一1676万方数据剂或阻止细胞黏附的药物,但是它们同时对眼部的其他组织如视网膜、角膜内皮、小梁结构有伤害。近年有学者提出用基因治疗PCO,并进行了一系列的实验研究,这为PCO提供了一条新的治疗途径。1 PCO的基因治疗基因治疗是将DNA分子在体外进行人工“剪切”、“拼接”和“组合”,使遗传物质重新构建,然后通过载体转入受体细胞进行无性繁殖,并使所需要的基因在受体细胞内表达,产生所需要的产物,从而达到治疗疾病的目的。随着基因治疗研究的逐步深入,其涉及的范围越来越广,PCO的基因治疗也逐步展开。基因治疗眼部疾病具有诸多优势:(1)眼位置浅表,导人治疗性基因相对简单;(2)基因导人后眼部发生的形态
15、学变化易于观察;(3)眼是免疫赦免组织。此外,眼球体积小、组织结构紧密,基因导入后不易扩散至周围组织,并与体循环相对分离,以上均为基因治疗提供了良好的基础。11 自杀基因治疗将某些细菌、病毒和真菌中特异性的基因转导人晶状体上皮细胞(1ens epithelialcells,LEC),此基因编码的特异性酶类能将原先对细胞无毒或毒性极低的前体药物在LEC内代谢成毒性产物,抑制DNA合成,从而导致细胞死亡,这类前体药物转换酶基因称为“自杀基因”。在基因治疗中,逆转录病毒载体是在具有分裂功能的细胞中进行基因转移和表达的载体,这一特点对其应用于靶向性治疗的实验研究有着十分重要的意义,因为在PCO早期,L
16、EC处于活跃分裂状态,而角膜内皮细胞等眼组织细胞多处于细胞周期的静止期。单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSVTK)基因是目前研究较深入的自杀基因。丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)属于鸟嘌呤类似物,能在HSVTK的作用下转变成一磷酸化形式化合物(GCVMP)。GCVMP在哺乳动物细胞内一些酶的作用下转变成三磷酸化合物(GCV-TP)。GCVTP具有高度细胞毒性,它能够与鸟苷酸竞争结合DNA聚合酶,掺入新生DNA链中,导致DNA合成终止,致使细胞死亡。若将HSVTK导人哺乳动物细胞内并使之表达,再给予一定浓度GCV治疗(
17、正常情况下对细胞无毒性),能将转染了HSVTK基因的细胞杀死,而且还可杀死周围没有转染HSVTK基因的细胞。Couderc等”1用含B一半乳糖苷酶逆转录病毒作为载体,将HSVTK基因转移到兔LEC内,在体外转染率为29,体内为10。在体外实验中,当加入GCV时,其对转染了HSVTK基因的LEC具有杀伤作用,当加入GCV的浓度为50 mgL“时,可以使LEC总数减少50。活体动物中,尽管有HSVTK基因表达,但未能有效抑制上皮细胞增殖。研究者认为可能是HSVTK基因表达水平过低的缘故。选择其他的载体可能会增加活体内HSVTK基因的转染率从而增加GCV的敏感性而杀死更多的LEC,这会使自杀基因更好
18、地运用于PCO的防治中。慢病毒是经由HIV21演变而来的一种RNA病毒,属于逆转录病毒亚类。染色体基因组中具有核苷酸定位信号序列,能高效地感染靶细胞,使得外源基因获得稳定表达。Yang等c6 3将带有HSVTK基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体转染至人LEC内,用荧光激活细胞分选术评估其转染效率,结果成功转染95以上LEC,当加入GCV的浓度为1525 mgL“时,转染HSVTK的LEC多呈凋亡或坏死状态,未转染的细胞因为混合了转染的细胞也有效地被杀死。Ding等o研究发现编码增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒群(reconstruct adeno associated virus,rAAV)2载体
19、能有效、稳定地转染到兔LEC(NN1003A)中,将转染rAAV2HSVTK的NN1003A细胞作为实验组,未转染rAAV2HSVTK的NN1003A细胞作为对照组,结果表明GCV的50抑制浓度在实验组和对照组分别为2 mgL“和524 mgL,GCV的杀伤效应随时间的延长而增加并有显著的旁观效应。实验组细胞的凋亡和坏死明显高于对照组,实验组的细胞停留在细胞周期S期的比率明显高于对照组,而停留在GOG1期的比率明显低于对照组。因此,GCV能有效杀死转染rAAV2HSVTK的NN1003A细胞,rAAV2介导的HSVTKGCV自杀基因系统也许能提供治疗PCO的有效新方法。Jiang等旧。将带有H
20、SV-TK基因和CreloxP慢病毒的载体转染至人LEC内,当加入GCV浓度为20 mgL“时,经过96 h治疗后,用电子显微镜可以观察到被转染的人LEC的凋亡和坏死,其凋亡率为8723。可证明CreloxP慢病毒一HSVTK系统也是一种可行的防治PCO的方法。12 bax基因治疗bax是一种促凋亡因子,属于bcl一2家族,在细胞凋亡调控中有重要作用,也是目前细胞凋亡研究的热点之一。Fang等一。行体外研究,利用标记有荧光蛋白的质粒将人的bax基因转染到人的LEC内,使用逆转录多聚酶链反应、蛋白免疫印迹法和荧光法检测bax和其抗凋亡类似物bcl一2的表达。通过有荧光活性的钙磷脂结合蛋白V抗体来
21、分析bax过度表达诱导的细胞死亡,用荧光显微镜和透射电子显微镜检查来评估细胞形态学和超微结构的变化。结果表明bax转染人的LEC后显著提高了bax基因的表达和bax与bcl-2的比率,但内源性的bcl-2几乎不表达。bax基因的高表达有显著地细胞毒性,诱导了天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的凋亡相关特性及活性。bax基因在人LEC中的高表达可通过凋亡途径触发人LEC的死亡。Malecaze等叫的实验发现在兔的超声乳化白内障吸出术后,在后囊内注入腺病毒介导的bax或半胱天冬酶前体一3基因可以阻止PCO的发生,同时证明了由腺病毒介导的bax基因或半胱氨酸天门冬酶前体一3的过分万方数据表达能够使残留的
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