2022年酶活性检测 .pdf
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1、分光光度法利用 底物 和产物光吸收性质的不同,可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。几乎所有的氧化还原酶 都使用该法测定。如还原型辅酶(NADH2) 和辅酶 (NADPH2) 在 340nm 有吸收,而NAD 和 NADP 在该波长下无吸收,脱氢酶 类可用该法测定。 该法测定迅速简便,自动扫描分光光度计的使用对酶活力 的快速准确的测定提供的极大的方便。酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑,我们要趋利避害。酶的积极作用我们要加强,在食品加工过程中添加酶制剂,使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免,可以通过加热等方法将酶灭活,消除其不利影响。为了将酶更好地应用于食品加工,研究酶的性质是
2、十分必要的。而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。下面我们来介绍用-可见分光光度计 测定酶活的具体方法。紫外 -可见分光光度法测定酶活:1. 一半乳糖苷酶一半乳糖苷酶,又称乳糖酶(Lactase) 。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量,从而提高乳制品的可消化性,用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变,同时还可用于生产低聚半乳糖。【酶活测定】以ONPG 为底物测定 -半乳糖苷酶活力。【酶活定义】 以 ONPG 为底物, 37保温酶解, 每分钟释放l mol/L邻硝基酚的酶量,定义为 1 个酶活力单位。2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismut
3、ase,简称 SOD) 是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类,是生物体内超氧阴离子清除剂,保护细胞免受损伤。SOD 广泛存在于各类生物体内,所有好氧微生物细胞中都含有SOD 。自 1969 年 Mccord 等人首次发现了SOD生物活性后,医学界对其医疗作用做了许多研究,证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫 力等作用,被专家称为21 世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。【酶活测定】在25 4.5ml 50mmol/L pH8.3的 K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测 SOD 样液, 再加入 10ul 50mmol/L的连
4、苯三酚, 迅速摇匀, 倒人光径lcm 的比色杯, 在325nm 波长下每隔30s 测一次 A 值。 同时测定Sigma 公司的 SOD 标准品,对所测样品SOD活性进行校正。【酶活定义】在lml 反应液中,每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50% 时的酶量为一个酶活单位,即 325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。3. 多酚氧化酶多酚氧化酶 (PPO) 是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶,其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO 的催化氧化后,具有单宁性质,易和蛋白质起交联作用而沉淀出来,进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大名师资料总结 -
5、 - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页,共 6 页 - - - - - - - - - 麦中部分 PPO 以“ 潜伏 ” 状态存在,在浸麦过程中,可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中,PPO 的活力较高,影响着麦芽的质量。因此,在制麦过程中应该降低PPO 活性。【酶活测定】 0.1mL 酶液与 lmL 0.1 mol/L邻苯二酚 (用 pH 8.4 柠檬酸 -磷酸缓冲液 配制)80oC 反应 3min ,用 2mL 20%TCA
6、终止反应,于波长450nm 处用分光光度计测定吸收值。【酶活定义】上述条件下,将每分钟OD 值增加 0.01 定义为 1 个酶活力单位。4. 葡萄糖氧化酶上世纪 60 年代以前,葡萄糖氧化酶主要用于蛋品加工业,除去葡萄糖,防止发生Maillard 反应,稳定产品质量,延长保质期。80 年代末,又陆续开发了去除啤酒溶解氧和瓶颈氧改善风味延长保质期、果汁果酒除氧护色稳定质量、面粉品质改善、 海产品和肉类保鲜、饲料添加去氧平衡畜禽胃肠代谢等用途,并建立了葡萄糖氧化酶专业生产车间。【酶活测定】采用-联 (二)茴香胺分光光度法。在有氧存在条件下,葡萄糖氧化酶催化葡萄糖脱氢产生H2O2 , 在过氧化物酶(
7、POD) 作用下,氧供体即邻一联(二 )茴香胺 (DH2) 被氧化成棕色产物。于436nm 处测量吸光率的变化,即可换算为葡萄糖氧化酶的活性。【酶活定义】 一个酶活性单位定义为在26 下每分催化释放一微克分子H2O2 所需的酶量。5. 果胶酶果胶酶可以改善葡萄酒的色泽、增加酒香,并提高葡萄酒出汁率等,对提高红葡萄酒的品质有重要作用。【酶活测定】向具塞试管中加入1.8mL 0.30% 聚半乳糖醛酸溶液(用 0.05 mol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液配制,调节pH 10.0) ,于 55水浴下保温5 min ,然后加入一定稀释倍数的酶液0.2 mL 反应 15 min , 加入 DN
8、S 试剂 1.5 mL , 混匀,在沸水中加热10min ,立即用自来水冷却,再加入21.5 mL 蒸馏水,混匀,于分光光度计上520 nm 测定吸光度。空白用煮沸失活的酶液代替。【酶活定义】在上述试验条件下,以每分钟分解底物产生1mol半乳糖醛酸所需的酶量为 1 个酶活力单位。6. 胰 -淀粉酶【酶活测定】 用移液管将0.5 mL 酶溶液移入试管, 并在水浴中调温至25。加 0.5 mL已同样预热到25 的 1% 淀粉溶液。3 min 后加 1.0 mL DNS显色剂。置试管于沸水中5 min ,冷却后用10 mL 蒸馏水稀释。用分光光度计于540 nm 处以空白作对照测定吸光度。以0.5
9、mL 磷酸盐缓冲液代替酶液测定空白值。7. 植酸酶【酶活测定】以植酸钠为底物,采用钒钼酸铵法测定植酸酶的酶活。吸取1 mmol/l的植酸钠 (酶作用底物,用0.25 mol/l 、pH 值 5.50 醋酸 -醋酸钠缓冲液配制)1.0 ml ,37 oC预热 5 min 后,准确加入适当稀释的酶液0.5 ml( 对照组先加反应终止液),37 oC 水浴反应名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页,共 6 页 - - - - - - - - - 30min 后,再加入4 m
10、l 反应终止液 (现用现配 )冷却至室温,在415 nm 处测定 OD 值,利用无机磷标准曲线计算出酶活。【酶活定义】在37,每分钟从1 mmol/l 植酸钠溶液中(用 pH 值 5.5 的醋酸 -醋酸钠缓冲液配制 )释放出 1 nmol 无机磷所需要的酶量为一个酶活单位。8. 羧甲基纤维素酶【酶活测定】在0.5mL 适当稀释的酶液中加入质量分数为0.625% 的羧甲基纤维素钠溶液,于50水浴中保温30min ,加 2.0 mL 质量分数为10%的 NaOH 溶液终止反应,再加入 2.5mLDNS试剂,于沸水浴中煮沸15min ,冷却,在550 nm 波长处比色,要求光密度读数尽可能在标准曲线
11、的0. 5 mg 葡萄糖处。每次测定均设立空白对照,对照管先加入0.5mL 酶液,然后加入2. 0 mL 质量分数为10%的 NaOH 溶液将酶灭活,再依次加入质量分数为 0.625% 的底物 2. 0 mL ,与待测管一起保温,加入DNS ,煮沸、冷却、稀释比色、与标准曲线对照。【酶活定义】在上述条件下,每30min 产生 0.5mg 还原糖为1 个 Cx 活力单位,即每1 h 产生 1.0mg 还原糖为 1 个 Cx 活力单位。9. 木聚糖酶木聚糖酶能水解不可溶戊聚糖(阿拉伯木聚糖 ),使其成为水溶性的,水解率达65% 。面粉中增加水溶性阿拉伯木聚糖,能提高面团的持水性和机械强度,使面团具
12、有更好的持气能力和操作耐力,进而提高馒头和面包的品质。【酶活测定】以木聚糖为底物,用DNS 法测定还原糖的生成量。取稀释酶液0.1ml ,加 1%木聚糖液0.9ml ,置 50水浴保温30min 后,加 DNS 2ml 于沸水浴中显色3min ,用自来水冷却后,加蒸馏水定容25ml ,测 O.D 值。【酶活定义】每毫升酶液每分钟水解木聚糖生成1mol木糖所相当的酶量。10. 蛋白酶【测定原理】中性蛋白酶在一定的温度和pH 条件下 ,水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸 ,在碱性条件下 ,将福林试剂还原,生成钼蓝与钨蓝,其颜色深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在660 nm 测定其吸光度,可得到酶解产
13、生的酚基氨基酸的量,计算出蛋白酶活力,以此代表蛋白酶的总酶活力。【酶活测定】取3 支试管 (一支空白管 ,两支样品管 ),分别向 3 支试管中准确加入稀释好的待测酶液1.0 mL, 将 3 支试管放入40水浴中预热5 min, 同时将测定底物(1% 酪素 )置同一温度水浴中预热5 min 。分别向两只样品管中加入1%酪素溶液1.0 mL, 准确计时 ,反应 10 min 取出。迅速准确向两只样品管加入0.4 mol/L三氯乙酸2mL, 于空白管中加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL 和 1.0 mL 1% 酪素溶液 ,摇匀。3 支试管中反应液用滤纸过滤。另取 3 支试管 ,分别吸取上述相应滤
14、出液1.0 mL,0.4 mol/L碳酸钠溶液5.0 mL 和稀福林试剂1.0 mL, 摇匀 ,置 40水浴中放置20 min( 显色 ),取出 ,迅速冷却置室温。以空白管调仪器零点,在分光光度计波长 660 nm 处分别测两支样品管吸光度,取平均值。通过查标准曲线求出生成酪氨酸的含量。11. -淀粉酶名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页,共 6 页 - - - - - - - - - -淀粉酶是第一个应用于面包制作的微生物酶,它取代了麦芽是由于麦芽中的淀粉酶含量不
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