5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件 (32张PPT).pptx
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1、资料一:刑侦破案杀手锏法医DNA鉴定技术,需要用到大量凶手DNA。资料二:肝炎病毒感染初期症状并不明显,抽取的血液中病毒含量也很少,在检测技术比较落后的时期常常造成误诊。资料三:新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测、新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测。新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒(RdRp基因、N基因、E基因)的医疗检测用品。它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA,进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR),通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大,最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性,那么就可以认为样本中存
2、在病毒(已经感染),反之表明样本中没有病毒(未感染)。资料四:在刑事侦破案件或遗传病的诊断过程中常需要对样品DNA进行分析,PCR技术能快速扩增DNA片段,在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝,有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。,专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,华师附中汕尾学校杨宇涛,一、基础知识,(一)PCR原理1.多聚酶链式反应(PCR):一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2.细胞内
3、的DNA复制(回顾)DNA的基本单位:脱氧核糖核苷酸DNA分子的结构:,含氮碱基,磷酸,5,DNA的羟基(-OH)末端称为3端,而磷酸基团的末端称为5端。,3,3,5,5,一、基础知识,(一)PCR原理2.细胞内的DNA复制(回顾)DNA的基本单位:脱氧核糖核苷酸DNA分子的结构:(两条链)反向平行,双螺旋结构DNA复制的时间:发生在有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期DNA复制的场所:细胞核(主要)、线粒体、叶绿体DNA复制的特点:边解旋边复制、半保留复制、多起点复制,一、基础知识,(一)PCR原理2.细胞内的DNA复制(回顾)DNA复制的条件,打开DNA双链,提供DNA复制的模板,合成子链的
4、原料,催化合成DNA子链,工作需要消耗ATP,催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,不能从头开始合成,只能从3端延伸DNA链,子链只从引物3端开始延伸;子链的合成方向总是5端向3端。,使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,作为DNA复制的起点,一、基础知识,(一)PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件DNA分子的热变性原理在80-100的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链重新结合成双链,这个过程称为复性。,一、基础知识,(一)PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件耐高温的TaqDNA聚合酶高温解决了打
5、开双链的问题,但是,又导致DNA聚合酶失活的问题,耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题,促成了PCR技术的自动化。自然引物(细胞内的DNA复制):RNA引物人工引物(PCR):DNA单链(主要)或RNA分别与两条模板链相结合的两种引物(引物和引物),一、基础知识,(一)PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件控制温度,但不需解旋酶;DNA模板;四种脱氧核苷酸;耐高温的聚合酶(TaqDNA聚合酶);分别与两条模板链相结合的两种引物(引物和引物);需要在一定的缓冲液中进行。,一、基础知识,(二)PCR的反应过程1.PCR的反应步骤:一般要经历三十多次循环,每次循环分
6、为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋,94,一、基础知识,(二)PCR的反应过程1.PCR的反应步骤:一般要经历三十多次循环,每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋,94复性引物与模板链结合,55,不考虑模板链重新结合:模板DNA比引物复杂的多;加入引物的量足够多而模板链数量少;引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。,一、基础知识,(二)PCR的反应过程1.PCR的反应步骤:一般要经历三十多次循环,每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋,94复性引物与模板链结合,55延伸DNA新链由5端向3端延伸(引物端为新链5端),72(TaqDNA聚合
7、酶最适温度),第1个PCR循环完成后:得到两个拷贝的靶序列,5,引物,5,引物,5,5,模板DNA,2530次循环(复制)后,模板DNA的含量可以扩大100万(220)倍以上。,引物数=新增单链数=22n-2,5,引物,5,引物,5,5,模板DNA,引物,引物,一、基础知识,(二)PCR的反应过程1.PCR的反应步骤:一般要经历三十多次循环,每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性:解旋,94复性:引物与模板链结合,55延伸:DNA新链由5端向3端延伸,723.PCR的反应结果从第二轮循环开始,前一轮循环的产物也作为模板参与反应,并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合,进行DNA的
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