结核杆菌核酸扩增荧光检测作业指导书.doc
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1、结核杆菌核酸扩增荧光检测作业指导书1 目的:保证TB DNA检测结果准确、可靠。2 适用范围:TB DNA的TaqMan荧光定量检测,标本类型为血清。3 负责人: 操作人: 4 原理:本试剂盒用一对结核杆菌特异引物和一条结核杆菌特异性荧光探针,PCR反应液,耐热DNA聚合酶(Taq酶),四种核苷酸单体(dNTPs)等成分,再用PCR体外扩增法检测结核杆菌DNA。5 性能参数:检出低值1103基因拷贝/ml。6 标本要求:(1)标本类型:血清。(2)标本采集:见标本采集手册。(3)标本储存和运输:室温放置不超过8小时,4-8不超过72小时,-20保存期6个月,应避免反复冻融。室温运输。(4)标本
2、拒收状态:细菌污染、严重溶血或脂血标本不能作测定。7 容器和添加剂类型:无菌离心管和无菌真空管。8 所需设备:ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱(4、-20)、生物安全柜、紫外灯9 试剂:DNA提取液(500l/管)2管;TB-PCR反应液(未贴标签管)20管;阳性定量质控标准品(1108基因拷贝/ml)(50l/管)1管;阴性质控品(250l/管)1管。10 校准程序(计量学溯源性):送深圳市计量检测所校准。11 程序步骤::11.1标本处理:标本采集、保存和运送 用无菌5ml玻璃管取受检者肺深部咳出痰液13ml,密闭,即为标本。或直接抽取外周血2ml(抗凝)。标
3、本可立即用于测试,也可保存于-20待测,保存期为六个月。标本运送应采用0冰壶。11.2标本及质控标准品的处理痰液中加入4倍体积的4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟。去上清,沉淀加无菌生理盐水1ml打匀,15000rpm离心5分钟;再重复洗涤一次。(知液标本直用淋巴细胞分离液分离沉淀)沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀,(提取液内含不溶于水的物质,取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象,可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。)沸水浴10分钟(误差不超过1分钟),转至4静置6-8小时以保证充分裂解。10,000rpm离心5分
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