HPLC培训教程.ppt
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1、一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?历史概述和定义液相色谱的定义是二十世纪早期由俄罗斯植物学家 Mikhail S. 茨维特提出的。他最先尝试在装满颗粒的柱子上使用溶剂来分离从植物中提取的化合物树叶色素。一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?混合物最有效的分离、分析方法。u色谱法是一种分离技术。u 混合物分离过程:试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。u 一相固定不动,称为固定相。u 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体),称为流动相。u 如果是气体称之为气相色谱,那液体就是液相色谱。一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?液相色谱的形式薄层色谱法 纸层析法
2、柱色谱法 一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?什么是高效液相色谱法HPLC?缩写 HPLC, 高压 (high-pressure) 早期的泵只能承受 500 psi 35bar。这就被称为高压液相色谱法HPLC随着这一期间不断的性能改进更小颗粒,更高压力, 字母缩写保持一样,但全称变为高效 (high-performance) 液相色谱HPLC。高效液相色谱HPLC是目前分析化学最强大的工具之一。它能够分离、定性和定量任何可以溶解在液体中的化合物。缩写LC是指Liquid Chromatography 一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?HPLC的特点的特点(一)(一) 项项 目目高效液相
3、色谱法高效液相色谱法经典液相色谱法经典液相色谱法色谱柱:柱长色谱柱:柱长/cm/cm 柱内径柱内径/mm/mm101025252 21010101020020010105050固定相粒径固定相粒径/m/m5 550507575600600色谱柱柱效色谱柱柱效(理论塔板数)(理论塔板数)2 210103 35 510104 42 25050柱压降柱压降/MP/MPa a5 515150.0010.0010.30.3进样量进样量/g/g1010-6-61010-2-20.10.11010分析时间分析时间/h/h0.050.051.01.01 12020一、什么是液相色谱一、什么是液相色谱?HPLC
4、的特点(二)项项 目目高效液相色谱法高效液相色谱法气相色谱法气相色谱法进样方式进样方式样品制成溶液样品制成溶液样品需气化或裂解样品需气化或裂解流动相流动相溶液溶液惰性气体惰性气体分离原理分离原理吸附、分配、筛析、亲和等吸附、分配、筛析、亲和等吸附和分配吸附和分配检测器检测器UVUV、PDAPDA、RIDRID等等TCDTCD、FIDFID、ECDECD等等应用范围应用范围低、中、高沸点有机化合物低、中、高沸点有机化合物离子型无机化合物离子型无机化合物热不稳定化合物热不稳定化合物生物活性分子生物活性分子低沸点有机化合物低沸点有机化合物永久性气体永久性气体三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如
5、何工作? 高效液相色谱系统的各组成部分。 储液瓶 、高压泵 、进样器、色谱柱、检测器 、数据记录系统 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 高效液相色谱系统的各组成部分。 储液瓶 、高压泵 、进样器、色谱柱、检测器 、数据记录系统 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 高效液相色谱操作高效液相色谱操作一个简单的方法来理解如何获得样品中化合物的分离,如下图所示 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 什么是检测器什么是检测器?当分开的染料谱带离开色谱柱后,它们马上进入检测器。检测器带有可以在流动相背景下看检测到每个分开的化合物谱带的流通池如图 H。 三、高
6、效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 几个常见检测器的类型几个常见检测器的类型紫外检测器荧光检测器蒸发光散射检测器 示差检测器光电二极管阵列检测器质谱仪MS三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 紫外检测器紫外检测器(UV) 应用最广,对大部分有机化合物有响应。 特点: 灵敏度高; 线性范围宽; 流通池可做得很小(1mm 10mm ,容积 8L); 对流动相的流速和温度变化不敏感; 波长可选,易于操作; 可用于梯度洗脱。 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器(PDA) 紫外检测器的重要进展; 光电二极管阵列检测器:10
7、24个二极管阵列,不但能得到分析全过程的色谱图,同时还能得到所有组分的光谱图(3D谱图)。 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? c. 示差折光检测器示差折光检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器。 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数 差值。差值与浓度成正比。 通用型检测器(每种物质具有不同的折光指数)。 灵敏度低,对温度敏感,不能用于梯度洗脱,不适合做衡量分析。 三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 质谱检测器(质谱检测器(MS) 样品在质谱部分和流动相分离,被离子化后,经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开,经检测器得到质谱图。具有高选择性、高灵
8、敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。什么是色谱图什么是色谱图?色谱图表示发生在高效液相色谱系统中的化学色谱分离。一系列从基线出现的峰以时间为坐标。每个峰代表对不同化合物的检测器反应。色谱图由计算机数据站描绘。如图 H. 色谱峰色谱峰保留时间(分)保留时间(分)基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值三、高效液相色谱如何工作三、高效液相色谱如何工作? 四、定性和定量化合物四、定性和定量化合物 定性和定量化合物 每一个洗脱物在一个特定的位置,时间段计算从进样零时到峰最高点洗脱出来为止。比较每个峰的保留时间tR和注入同一色谱系统的标准物质相同流动相和固定相的保留时间,色谱工作者就可能鉴定
9、每一个化合物。检测器基本上反映化合物谱带通过流通池的浓度。浓度越高,信号越强,峰面积越大。 五、等度和梯度液相系统操作五、等度和梯度液相系统操作等度和梯度液相系统操作等度和梯度液相系统操作高效液相色谱使用两种基本的洗脱模式。第一种称为等度洗脱等度洗脱。在这种模式下,流动相,无论是纯溶剂或混合物,在整个操作过程中保持不变。第二种称为梯度洗脱梯度洗脱,正如名称所指,流动相的组成在分离过程中发生变化。如20%甲醇20分钟变为80%甲醇。这种模式对含有多种不同色谱极性化合物的样品非常有用。随着分离的进行,流动相的洗脱强度逐渐增强以洗脱出更强保留的样品组分。六、高效液相色谱柱硬件六、高效液相色谱柱硬件
10、色谱柱色谱柱 色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成,而且相对于分离系统样品,流动相和固定相来说具有化学惰性。为承受尽可能高的压力,大多数色谱柱由不锈钢制成。分离性能分离性能 - 分离度分离度 两种化合物分离的程度称为色谱分离度RS。 由色谱柱决定的总体分离能力或分离度的两个主要的因素是,机械分离能力:由色谱柱长度,粒径和填料床层的均一性决定;化学分离能力:由填料和流动相对化合物的物化竞争决定。效率是衡量机械分离能力的指标,选择性是化学分离能力的指标。机械分离能力机械分离能力 - 效率效率 如果色谱柱床稳定均一地填充,它的分离能力就由柱长度和颗粒大小决定。机械分离能
11、力,也叫效率,通常以塔板数符号是N来测量和比较。较小颗粒色谱床有较高效率和反压。对于固定的颗粒大小,增加色谱柱长度可获得更强的机械分离能力。然而,代价是色谱运行时间延长,更多溶剂消耗和更高反压。减少色谱柱长度可以减小以上变量但也降低了机械分离能力。六、高效液相色谱柱硬件六、高效液相色谱柱硬件 色谱柱色谱柱色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:常规分析柱(常量柱),内径25mm(常用4.6mm),柱长1030cm;窄径柱(narrow bore,又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn),内径12mm,柱长1020cm;毛细管柱(又称微柱microcolumn),内径
12、0.20.5mm;半制备柱,内径5mm;实验室制备柱,内径2040mm,柱长1030cm;生产制备柱内径可达几十厘米。 六、高效液相色谱柱硬件六、高效液相色谱柱硬件 色谱柱的发展方向色谱柱的发展方向1. 因强调分析速度而发展出短柱,柱长310cm,填料粒径23m。为提高 分析灵敏度,与质谱(MS)联接,而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱(microbore)。细管径柱的优点是:节省流动相;灵敏度增加;样品量少;能使用长柱达到高分离度;容易控制柱温;易于实现LC-MS联用。2. 但由于柱体积越来越小,柱外效应的影响就更加显著,需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测),更小死体
13、积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出1100l/min的低流量,进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小,要求高灵敏度的检测器,电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 总的来说,化合物的三种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离。它们是: 极性极性 电荷电荷 分子大小分子大小七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离 结构经常决定这个分子是极性还是非极性。有机分子根据结构经常决定这个分子是极性还是非极性。有机分子根据它含有的主要官能团来分类。使用基于极性的分离模式
14、,不同它含有的主要官能团来分类。使用基于极性的分离模式,不同分子的相对色谱保留时间大都由这些官能团的本性和位置决定。分子的相对色谱保留时间大都由这些官能团的本性和位置决定。基于极性的色谱分离是根据相似物的相互吸引和不同物质的相基于极性的色谱分离是根据相似物的相互吸引和不同物质的相互排斥。互排斥。 设计一套色谱分离系统设计一套色谱分离系统如图如图Q,我们通过选择流动相和固,我们通过选择流动相和固定相制造样品中各种化合物的竞争。这样,样品中和固定相定相制造样品中各种化合物的竞争。这样,样品中和固定相柱柱填料填料极性相似的化合物将被延迟因为它们更强地被颗粒吸引。极性相似的化合物将被延迟因为它们更强地
15、被颗粒吸引。而和流动相极性相似的化合物将优先被吸引而移动较快。而和流动相极性相似的化合物将优先被吸引而移动较快。 基于基于极性的分离极性的分离 极性分子非极性分子这样,基于流动相和固定相对极性分子非极性分子这样,基于流动相和固定相对不同化合物的相对吸引力不同而产生了分离。不同化合物的相对吸引力不同而产生了分离。图 Q: 适当流动相和固定相的组合影响基于极性的分离七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离常用流动相极性:常用流动相极性:石油醚汽油庚烷己烷二硫化碳二甲苯甲苯氯丙烷苯溴乙烷溴化苯二氯乙烷三氯甲烷异丙醚硝基甲烷乙酸丁酯乙醚乙酸乙酯正戊烷正丁醇苯酚甲乙
16、醇叔丁醇四氢呋喃二氧六环丙酮乙醇甲醇乙腈甲酰胺水固定相颗粒色谱极性:固定相颗粒色谱极性:C18 C8 CN Silica官能团极性大小官能团极性大小(样品)样品) 烷烃(烷烃(CH3,CH2)烯烃()烯烃(CH=CH)醚类()醚类(OCH3,OCH2)硝基化合物)硝基化合物(NO2)二甲胺(二甲胺(CH3NCH3)脂类(脂类(COOR)酮类()酮类(CO)醛类()醛类(CHO)硫醇()硫醇(SH)胺类()胺类(NH2)酰胺()酰胺(NHCOCH3)醇类()醇类(OH)酚类(酚类(ArOH)羧酸类()羧酸类(COOH)七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离
17、 考虑到流动相和固定相的极性,对于某一固定相,必须选择一个流动相,使得感兴趣的分析物可以结合在色谱柱上,但不能太强而洗脱不下来。在具有类似极性强度的溶剂中,考虑固定相和流动相的配合,可以区分分析物极性和溶解性的更微弱的差别,使色谱系统的选择性最大化。总而言之,色谱学家会选择最佳的具有合适相反相极性的流动相和固定相的组合。之后,当样品流过色谱柱的时候,同性相吸的原则将决定哪一种分析物流速放缓(出峰慢),哪一种流速更快(出峰快)。 七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离正相高效液相色谱正相高效液相色谱图 S -1 代表三个染料混合物的正相色谱分离。极性的固定
18、相极性的固定相最强地保留了极性的黄色染料。相对非极性的蓝色染料在非极性溶剂的流非极性溶剂的流动相动相保留竞争中胜出,很快被洗脱出来。由于蓝色染料最像流动相两者都是非极性,它流动得更快。对硅胶柱正相色谱来说,典型的情况流动相是100% 极性较小的有机相,不含水。样品是极性小的先出峰样品是极性小的先出峰图 S -1: 正相色谱法七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于极性的分离基于极性的分离反相高效液相色谱(最常用)反相高效液相色谱(最常用)反相是指与正相恰好相反的色谱模式,即使用极性流动相极性流动相和非非极性极性疏水性如疏水性如C18固定相固定相。图 S-2 描述了三种染料的黑色混
19、合物被该种方法分离的过程。样品是极性大的先出峰样品是极性大的先出峰图 S -1: 反相色谱法七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于电荷的分离基于电荷的分离: 离子交换色谱离子交换色谱IEC离子交换分离的固定相以表面酸碱性强弱和吸附保留的离子类型来划分。阳离子交换是用负电荷表面来保留和分离带正电荷的离子。反之亦然,阴离子交换是用正电荷表面来保留和分离带负电荷的离子。离子抑制色谱法:离子抑制色谱法:通常改变流动相的通常改变流动相的pH值被中和,使其失去吸附力而被洗值被中和,使其失去吸附力而被洗脱脱 。七、高效液相色谱分离模式七、高效液相色谱分离模式 基于尺寸大小的分离:基于尺寸大小
20、的分离:排阻色谱SEC - 凝胶渗透色谱GPC十九世纪五十年代,Porath 和 Flodin发现生物分子可以通过过滤或流经孔径可控的亲水右旋糖苷聚合物时按照大小被分开,而不是基于电荷数或极性。这个过程被称为凝胶过滤。后来,一种类似的装置,使用特定孔径范围的有机聚合物填料可分离合成寡聚物和多聚物。这个过程成为凝胶渗透色谱GPC。使用孔径可控的硅胶填料操作类似的分离过程被称作排阻色谱SEC。八、液相色谱分析方法的建立八、液相色谱分析方法的建立1 . 色谱柱的选择:色谱柱的选择:疏水性的样品疏水性的样品反相键合色谱;反相键合色谱;亲水性的样品亲水性的样品正相键合色谱;正相键合色谱;生物大分子生物大
21、分子 体积排阻色谱;体积排阻色谱;无机离子化合物无机离子化合物离子对色谱;离子对色谱;高分子聚合高分子聚合 凝胶色谱;凝胶色谱;同系物的分离同系物的分离吸附、分配和键合色谱;吸附、分配和键合色谱;同分异构体同分异构体 双键或取代基异构用吸附色谱;双键或取代基异构用吸附色谱; 多环芳烃异构选用反相键合;多环芳烃异构选用反相键合;对映异构体对映异构体 流动相加入手性选择剂或具有光流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。学活性的固定相。八、液相色谱分析方法的建立八、液相色谱分析方法的建立2.流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择:根据分析样品的结构、性质,结合色谱分
22、析法确定流动根据分析样品的结构、性质,结合色谱分析法确定流动相。相。为达到较好的分离效果,确定流动相配比。为达到较好的分离效果,确定流动相配比。流动相的总流量增加,通常柱效增加。流动相的总流量增加,通常柱效增加。梯度洗脱梯度洗脱-在洗脱过程中连续或间断的改变流动相在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成,来改善分析效果的技术。适用范围:当样品中的组成,来改善分析效果的技术。适用范围:当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。特殊要求:当分析弱酸、弱碱性化合物时,可通过采用特殊要求:当分析弱酸、弱碱性化合物时,可通过采用缓冲溶液及调节流动相的缓冲溶液
23、及调节流动相的Ph值来改善峰型。值来改善峰型。九、样品分析方法介绍九、样品分析方法介绍1 流动相的准备流动相的准备 流动相的流动相的选择选择-有机相(色谱级甲有机相(色谱级甲醇、色谱级乙腈)与水(超纯水、缓冲溶醇、色谱级乙腈)与水(超纯水、缓冲溶液)液)流动相的流动相的过滤过滤-用孔径为用孔径为0.45m滤滤膜过滤除去固体颗粒杂质。膜过滤除去固体颗粒杂质。流动相的流动相的脱气脱气-超声脱气、吹氦脱超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。空脱气法。2 样品的准备样品的准备称量称量、用流动相超声、用流动相超声溶解溶解、过滤过滤。九、样品分析
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