PCR技术及习题.doc
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1、PCR技术及习题PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链式反应1、PCR原理:在解旋酶作用下,打开DNA双链,每条DNA单链作为母链,以4中游离脱氧核苷酸为原料,合成子链,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链。2、PCR反应过程是:变性复性延伸类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火(复性)-延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性:当温
2、度上升到90以上时,双链DNA解聚为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):温度下降到50左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合;引物的延伸:72左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5端向3端延伸。3、结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。4、细胞被DNA复制与PCR技术的比较:细胞内DNA复制体外DNA扩增(PCR)不同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80100高温解旋,双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶
3、TaqDNA聚合酶引物RNADNA、RNA温度体内温和条件高温相同点需提供DNA模板四种脱氧核苷酸为原料子链延伸的方向都是从5端到3端知识点拨:1、DNA分子复制的人工控制解开螺旋:在80100时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。恢复螺旋:在5060左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。2、PCR的含义是多聚酶链式反应。3、PCR技术反应的条件:稳定的缓冲溶液环境(一般使用Tris-Cl缓冲液,标准的为10mmol/L,并将其调节到8.38.8之
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