克隆载体与表达载体.doc
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1、克隆载体基本性质基本特征(或载体的构建)原理机制常用的载体克隆载体质粒载体质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制;不相容性;可转移性(基因工程中采用非接合性质粒)(1)具有合适的复制起始位点(ORI)(2)具有合适的选择性标记基因(3)若干限制性内切酶的单一位点(4)具有较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后,受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基(选择培养基)中生长。(抗菌素选择原理)pSC101ColE1pBR322pUC18pUC19TA载体噬菌体载体噬菌体其DNA两端的5末端各带有12个碱基的互补单链,即cos位点。有可
2、替代区,即非必需区。用外源DNA片段替代这个区域,不会影响噬菌体颗粒的形成。(1)基因组大小;去除非必需区,建立外源DNA片段的克隆或替换位点(2)在DNA的非必需区插入选择标记:lacZ 基因;基因 c 失活(cI基因:溶源过程控制基因);Spi 筛选(野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型,称作 Spi+ ,即对 P2 噬菌体的干扰敏感)1) 通过裂解过程增殖载体2)载体与外源DNA的酶切3) 外源DNA与载体的连接4)重组噬菌体的体外包装5) 包装噬菌体颗粒的感染6)筛选(噬菌体载体的克隆原理)插入式载体置换型载体(取代型载体)M13噬菌体
3、载体M13 噬菌体的基因组为单链 DNA。噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的,不存在包装限制。只感染雄性大肠杆菌基因间隔区(intergenic region, IG区) 基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区,内含有复制起始位点,是实施改造、构建人工载体的重点区域。 IG区内只有一个 Bsu I 切点。(2)加入酶切位点,在IG区内加入单一内切酶位点。M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ(a-肽序列)。使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外,M13重组分子筛选简便,被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢,形成混浊斑,易于辨认挑选。而且重组分子越大,混浊斑
4、的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小,只有1.5 kb1、以(+)链DNA为摸板,合成互补()链,该双链称复制型DNA(RFDNA)。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖,可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在(+)链上,从而阻断了其互补链,即()链的合成,这样,细胞就会不断的合成(+)链DNA 4、游离出来的(+)链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物,然后转移到寄主细胞膜,同时基因V的蛋白质从(+)DNA链上脱落下来,余下的M13(+)链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中,被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 (M1
5、3噬菌体产生单双链DNA的机制)M13mpn n代表系列数字 对M13mp1的改进加上常用的酶切位点。 M13mp2:LacZ 5端的第13个核苷酸G突变成A,产生了一个EcoR I切点噬菌体-质粒杂合载体黏粒载体考斯质粒是一类人工构建的含有-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像l -DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞;能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力:45kb;具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒(cosmid)是带有 cos 序列的质粒。 cos 序列是 l 噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。黏粒的组成包
6、括质粒复制起点(colE1),抗性标记(ampr), cos 位点,因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。有的粘粒载体含有两个 cos 位点,在某种程度上可提高使用效率。设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组,就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此,插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌,并在细菌细胞中复制。噬菌粒载体能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装,并高效转染受体细胞
7、 装载量比常规的M13mp系列要大很多(10 kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA重组操作简便,筛选容易 噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点,含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区(含有噬菌体DNA复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件)它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等,方便DNA的操作,可在细胞内稳定存在;又具有单链噬菌体的复制起点,在辅助噬菌体的存在下,可进行噬菌体的繁殖,产生单链的子代噬菌体1. 具有较小分子量基因组DNA,可克隆10kb的外源DNA片段,并易于进行分离与操作;2. 编码一个
8、ampr基因作为选择记号,便于转化子的选择;3. 拷贝数含量高4. 存在着一个多克隆位点区,因此多种不同类型的外源DNA片段,不经修饰便可直接插入到载体分子上;5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区,可按照IPTG显色反应试验筛选6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下,插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达;7含有质粒的复制起点,可复制形成大量的双链DNA分子8. 带有一个M13噬菌体的复制起点,在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中,可以合成出单DNA拷贝,并包装成噬菌体颗分泌到培养基中;9.;在pUC118和pUC119这两个载体中,多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相
9、反的,于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA,另一个则可转录出负链DNApUC118和pUC119人工染色体染色体具有复制功能,利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展,甚至可以跟染色体的大小相媲美。 人工染色体载体拷贝数少,制备困难,通常采取“穿梭载体”的策略来解决含有质粒载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点,这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制, 含有第二受体(如酵母)端粒(TEL)、DNA复制起始位点(ARS)和着丝粒(CEN)以及合适的选择标记。载体在
10、体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞,按照染色体复制的形式进行复制和传递。 筛选第一受体的克隆子一般采用抗生素抗性选择标记;筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型。酵母人工染色体载体YAC细菌人工染色体载体 BACP1噬菌体人工染色体载体PAC质粒载体总结质粒载体类型长度选择标记克隆位点pSC101天然质粒,属严紧型、低拷贝型9.09 kb四环素抗性Tetr7个克隆位点: EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColE1天然质粒,属松弛型多拷贝型6.3 kb大肠杆菌素(colicin)E1和对E1免疫的基因
11、(immE1)EcoR I位于E1内部,插入外源DNA会导致E1失活,使受体菌不能合成E1(ColE1-),但仍然表现出对E1免疫型(ImmE1+)pBR322元件来源 复制起点 orip MB1系列(来源于ColE1)的高拷贝型复制起点 Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。4363bp氨苄青霉素和四环素抗性24个克隆位点。其中9个会导致Tetr基因失活(如BamH I、Hind 、Sal I); 3个会导致Ampr基因失活(Sca I、PvuI、Pst I)。 pUC系列(i)来自pBR322质粒的复制起点(ori);(ii)氨苄青霉素
12、抗性基因(ampr),但它不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点;(iii)大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ基因;(iv)位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点(MCS)区段,但它并不破坏该基因的功能2.7kbAmpicillin 抗性和 lacZ的 肽互补(蓝白斑)相结合。10个连续的单一限制酶切位点,位于lacZ基因的5端。TA载体耐热聚合酶可在PCR产物的3端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷(A)。根据这一特点研制出线性TA质粒载体,其5端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶(T),用该载体可进行PCR产物的直接克隆。TA载体构
13、建:在一般质粒载体的基础上构建。方法1:先采用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化,再通过K1enow片段将酶切的线性载体末端补平方法2:利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端,最后将线性化钝末端质粒载体加T反应形成。目前有很多公司推出了TA质粒载体。噬菌体载体噬菌体载体分类插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体噬菌体载体相对于质粒载体来说,克隆片段较大,所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。 cI基因插入失活:如 gt10、NM1149等载体,在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致
14、噬菌体不能溶原化,产生清晰的噬菌斑。相反,产生混浊的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活:如charon16A载体,在非必须区段引入lac Z基因,在lac Z基因上有EcoR I位点,插入失活后利用X-gal法筛选(蓝白筛选)置换型载体(取代型载体)具有成对的克隆位点,在这 两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA 片段所取代。野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的,外源DNA可以取代这一片段这些载体是用Lac 5 替换入噬菌体的中间区段,同时将Lac 5 作为选择标记使用时用EcoRI水解,去掉中间的片段,再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后,感染E.coli使之在E.c
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