TR-PCR(3页).doc
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1、-TR-PCR-第 3 页逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择1 Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有
2、强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。2 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2 存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。4MMLV反转录酶的RNase H-突变体:商品名为SuperScript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择1 随机六聚体引物
3、:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2 Oligo(dT):是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A )尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3 特异性引物:最特异的引发方法是用含目标
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