性病实验室梅毒SOP1资料.doc
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1、山东省皮肤病医院性病实验室操作手册文件名称梅毒螺旋体检测标准操作规程编 码页 数实施日期制 订 人审 核 人批准人制订日期审核日期批准日期目 的:标准的梅毒螺旋体检验操作,确保检测结果准确。适用范围:性病实验室工作人员责 任 人:实验操作者1、标本的采集与处理操作应标准化。所有标本都应当被视为具有传染性,医务人员应戴手套慎重操作。梅毒的实验室诊断主要有病原体检测和血清学检测方法,各期梅毒的检测方法及部位见下表。临床表现取材部位检查方法一期梅毒溃疡、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查二期梅毒皮损、淋巴结、血液暗视野检查、血清学检查潜伏梅毒血液血清学检查三期梅毒血液、脑脊液血清学检查神经梅毒血液、
2、脑脊液血清学检查血液1.2.1.1血清标本根据需要,用一次性真空采血针与促凝采血管抽取静脉血2-5 ml,室温静置1-2小时或37静置30分钟,待血液凝固、血块收缩后,3000r/min离心10-15分钟,别离新鲜血清,备用。也可采用保存于2-8或-20的血清。溶血、脂血或污染的标本可影响试验结果。1.2.1.2血浆标本根据需要,用一次性真空采血针与抗凝采血管抽取静脉血2-5 ml,轻轻颠倒混匀8-10次,3000r/min离心10-15分钟,别离血浆,备用。血库血浆以及EDTA抗凝血浆同样可以用于梅毒血清学实验一般仅用于RPR实验,但易出现假阳性反响需用血清复试,如用其他抗凝剂应首先评价后再
3、用。1.2.1.3末梢全血消毒局部皮肤成人和1岁以上儿童可选择手指或耳垂,1岁以下儿童采用足跟部。一次性采血针刺破皮肤,用无菌棉签擦掉第一滴血。收集滴出的血液,立即用于检测。1.2.2皮损部位组织液.1用于病原学检查用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损外表的污物,钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位,取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片立即用于暗视野显微镜检测,或取渗出液直接涂片,用于镀银染色试验。.2用于核酸检测用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损外表的污物,钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位,刮取渗出液,参加有DNA保存液1ml/管的标本管中,备用。淋巴液无菌操作下穿刺腹股沟淋巴结,注入0.
4、3ml无菌生理盐水并反复抽吸2-3次,取少量的淋巴液直接滴于载玻片上,加盖玻片后立即进展暗视野镜检或备用。脑脊液操作由专业人员进展,一般用腰椎穿刺术获得。患者侧卧于硬板床,两手抱膝紧贴腹部,头向前胸屈曲,使躯干呈弓形,以髂后上棘连线与后正中线的交点为穿刺点,相当于第3-4腰椎棘突间隙,消毒处理后,用2%利多卡因自皮肤到椎间韧带作局部麻醉。术者用左手固定穿刺皮肤,右手持穿刺针以垂直背部方向缓缓刺入,针尖稍斜向头部,成人进针深度约4-6cm,儿童约2-4cm。当针头穿过韧带与硬脑膜时,有阻力突然消失落空感,此时可将针芯慢慢抽出,即可见脑脊液流出,至于适宜的容器中,备用。核对样品与运送单,检查样品管
5、有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出,对样品管和盛器消毒并做记录。检查样品的状况,记录有无严重溶血、微生物污染、脂血以及黄疸等情况。如果样品污染或者认为样品不能被承受,应将样品平安废弃。并将样品情况立即通知运送机构。对不合要求的标本,可以拒绝承受。2、梅毒的实验室检查原理梅毒螺旋体侵入人体后,在皮肤黏膜下增殖,并很快沿着淋巴管到达附近淋巴结,经过2-4周的潜伏期,在侵入部位发生炎症反响,称为硬下疳,数天到1周后,淋巴结肿大。二期梅毒是梅毒螺旋体由局部经淋巴结进入血液,在人体内大量播散后而出现的全身表现,一般发生在感染后的7-10周或硬下疳出现后6-24周,主要为皮肤黏膜损害,有扁
6、平疣、黏膜斑和玫瑰斑疹等。患梅毒的孕妇可以通过胎盘使胎儿受染。研究证明,在妊娠期7周时,梅毒螺旋体即可通过胎盘。其梅毒患者硬下疳、淋巴结、皮肤黏膜损害以及孕妇羊水中均可检查到梅毒螺旋体。将标本置于暗视野显微镜下,光线从聚光器的边缘斜射到涂片上,可使梅毒螺旋体折射出亮光,从而可根据其特殊形态和运动方式进展检测。方法.1仪器耗材:1) 暗视野显微镜2) 无菌纱布3) 不锈钢刮刀4) 灭菌棉拭子5) 载玻片、盖玻片6) 注射器,注射针头7) 灭菌生理盐水.2检测流程1) 将待检标本制成生理盐水涂片,加盖玻片后立即备检。2) 在预先调整好的暗视野显微镜的聚光器上加数滴浸油,轻轻调低聚光器,使之在载物台
7、下方。3) 将标本玻片置载物台上,上升聚光器,使浸油接触载玻片底面,防止浸油内有气泡。4) 镜检:先低倍后高倍,寻找有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体。结果.1结果判读:在暗视野显微镜下观察,发现有纤细、白色、有折光的螺旋状微生物,长6-20um,um,有6-14个螺旋,具有旋转、蛇行及伸缩等特征性的运动方式,可判断为梅毒螺旋体。.2结果报告:暗视野显微镜下假设发现上述特征的梅毒螺旋体那么报告阳性结果;未见到上述特征的梅毒螺旋体那么报告阴性结果。临床意义1) 梅毒螺旋体暗视野显微镜检测阳性在临床上可确诊梅毒,特别是对于有皮肤黏膜损害和淋巴结病变的一、二期梅毒的诊断具有重要价值,且具有快速,方便,
8、易操作等特点。2) 假设未能发现梅毒螺旋体,不能排除梅毒诊断。阴性结果原因可能为:标本中的微生物数量缺乏单次的暗视野检测其敏感性低于50%、病人已承受治疗、皮损已接近自然消退或取自非梅毒性皮损。3) 无论暗视野显微镜检查的结果如何,都应进一步进展血清学检测。考前须知1) 取材前,应用无菌生理盐水清洁皮肤外表,取材时应注意无菌操作。2) 应取到组织渗出液,尽量防止出血,以提高检出阳性率。3) 取材后应立即置暗视野显微镜下观察,如搁置太久,梅毒螺旋体活动能力会下降,导致镜下难以观察到阳性结果。4) 对口腔溃疡标本,在暗视野显微镜下如观察到梅毒螺旋体的特征性形态和运动方式,应与其他螺旋体相区别。2.
9、2.甲苯胺红不加热血清试验TRUST原理梅毒螺旋体一旦感染人体,宿主迅速对感染早期被损害的自身细胞以及梅毒螺旋体细胞外表所释放脂类物质做出免疫应答,在3-4周内可产生抗类脂抗原的抗体亦称为反响素。这种抗体在体外可与心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的抗原0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂和0.90%胆固醇发生抗原-抗体反响。心磷脂、卵磷脂和胆固醇都是醇溶性脂类,遇水形成胶体溶液。当含有反响素的梅毒血清与之混合时,即粘附在胶体颗粒的周围。经摇动、碰撞,形成抗原抗体复合物,出现凝集颗粒,即为阳性反响。甲苯胺红不加热血清试验即在抗原中参加甲苯胺红颗粒作为指示物,与待检血清浆中的反响素结合,形成肉眼可见的红
10、色絮状物。血清不需灭活,肉眼可观察结果。方法.1仪器耗材:1) TRUST试剂盒2) 水平旋转仪:要求旋转环状直径为2cm,转速为1002r/min,并带有计时器和保湿盖3) 无菌生理盐水0.9%.2检测流程:1) 试剂准备:检测前将试剂盒置室温预温30分钟2) 加标本:吸取50l血清浆置试验卡片圈中,并均匀地涂布在整个卡圈内。不能将标本溢出环圈外面。3) 加抗原:将抗原轻轻摇匀,在每个标本圈中,用专用滴管针头垂直滴加1滴601滴/ml,约17l/滴抗原,不需要手工混匀。4) 反响:将卡片置水平旋转仪上,建议罩上保湿盖,1002r/min旋转8分钟。5) 从旋转仪中取出卡片后立即在亮光下用肉眼
11、观察结果。用手轻微的旋转或倾斜卡片可有助于弱阳性和阴性标本。1) 实验卡片准备:在卡片中圈1到圈4中分别标上1:2,1:4,1:8,1:162) 稀释液准备:在圈1到圈4中参加50l生理盐水,勿将盐水液滴涂开。3) 标本稀释:吸取50l血清浆于圈1中,用移液器来回吸放5-6次已混合圈1中的生理盐水和标本,但要防止产生气泡。从圈11:2中移取50l到圈21:4用上述同样方法混合后依次稀释至圈31:8和圈41:16。混旋后从圈4中弃去50l。4) 依次从圈4-圈1将不同稀释度的标本涂布整个圈内。5) 加抗原等以下实验步骤同定性试验的2-4。6) 如阳性反响滴度大于1;16,那么继续稀释以测定最高稀
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