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1、-蛋白裂解液-第 4 页蛋白质的定位与蛋白质裂解液的选择:全细胞:NP-40或RIPA细胞质(可溶):Tris-HCl细胞质(细胞骨架):Tris-Triton细胞膜:NP-40或RIPA细胞核:RIPA线粒体:RIPARIPA裂解液配方1ml RIPA buffer contains 35l proteinase inhibitor and 10l phosphatase inhibitorRIPA buffer最终浓度1M Tris-HCl (pH7.5)5 ml50mMNaCl0.87g0.15 MNa-deoxycholale0.1g(0.1%)0.5M EDTA(pH8.0)0.8m
2、lNaF41 mgNonidet P401 ml(1%)Aprotinin10g/l100l10g/ml加水到 100mlAprotinin 10g/l ;用10mM HEPES-KOH(PH8.0)溶解,备用。l Nonidet P-40简称NP-40,乙基苯基聚乙二醇,常用非离子性去垢剂。l Na-deoxycholale,脱氧胆酸钠,离子型去垢剂。离子型去垢剂主要作用有:裂解细胞;溶解蛋白,尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白,如膜蛋白等;很适合做WB,但在Co-IP中使用,需要谨慎。l 亮抑霉肽(Leupeptin):抑制丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、猪胰激肽原酶)和半胱氨酸蛋白酶(包
3、括木瓜蛋白酶和组织蛋白酶B)l 抑肽素A(Pepstatin A)抑制各种天门冬氨酸蛋白酶,例如组织蛋白酶D、肾素、胃蛋白酶、细菌天门冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶;l 胰凝乳蛋白酶抑制剂(Chymostatin)抑制具有糜蛋白酶类特异性丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、胃促胰酶、组织蛋白酶 G)和大多数丝氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶B,H,L) l 抗木瓜蛋白酶(Antipain)抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纤溶酶。l 氟化钠抑制酸性磷酸酶l 正钒酸钠:抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶 (tyrosine phosphatase)l 焦磷酸钠 (sodium pyrophosphate):抑制丝氨酸-苏氨酸磷
4、酸酶(serinethreonine phosphatase) 。在与蛋白相关的检测中,首先最关键的一步便是蛋白质的提取。蛋白质的提取过程中,我们要经常加和蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸化蛋白的研究过程中,磷酸酶抑制剂也是必不可少的,本文总结了常用的蛋白酶抑制剂PMSF,Leupeptin 亮肽素,Aprotinin抑肽酶,Pepstatin胃蛋白酶抑制剂,EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制剂NaF氟化钠,Na3VO4 原矾酸钠 ,BETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠,Na2P2O4 焦磷酸钠等。对这些蛋白酶抑制剂的溶解配制,贮存液与工作液浓度,保存都做了详细的说明
5、。蛋白酶抑制剂PMSF:特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶(可逆的地面处理)。 溶解性:溶于异丙醇,乙醇,甲醇和丙二醇果10mg/ml。在水溶液中不稳定。在100%异丙醇, +25时稳定至少9个月分子量:174.2使用:贮存浓度:200mM,工作浓度:1mMLeupeptin 亮肽素特性:抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,纤溶酶,和组织蛋白酶B溶解性:高度溶于水(1mg/ml)。4一周稳定,分成小份冷冻在-20至少6个月分子量:C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4 x 1/2 H2
6、SO4 x H2O:493.6使用:贮存浓度:1mg/ml,工作浓度0.5 ug/ml (1mM)Aprotinin抑肽酶特性:丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶, 激肽释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。溶解性:易溶于水(10mg/ml)或缓冲液(例如,tris,0.1M,pH8.0)。pH约7-8的溶液在4可保存1周,分装保存在-20可至少保存6个月。避免反复冻融, pH12.8的碱性环境可使其灭活。分子量:6,512使用:贮存浓度:1mg/ml, 工作浓度:0.062.0 ug/ml(0.010.3 uM)Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性:抑制天冬氨酸(酸)蛋
7、白酶如胃蛋白酶,肾素,组织蛋白酶D,凝乳酶, 许多微生物酸性蛋白酶溶解性:溶于甲醇约1mg/ml; 可溶于乙醇,过夜溶解可达到1 mg/ml;在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。4稳定一周,分装储存于-20时可保存1个月分子量: 685.9使用:贮存浓度:1mg/ml,使用浓度:0.7 g/ml(1 M)EDTA-Na2特性:金属蛋白酶抑制剂溶解性:溶于水至0.5M,在pH8-9的条件下,4稳定至少6个月分子量: 372.24使用:工作浓度:0.20.5 mg/ml(0.51.3 mM),不需现用现配,在溶液pH值调至8-9时再加入。磷酸酶抑制剂NaF氟化钠 溶解性:溶于水分子量: 41.
8、99使用: 贮存液:5M 工作浓度:10-20mMNa3VO4 原矾酸钠 分子量:183.91溶解性:溶于水,我们购买过来的是原矾酸钠.原矾酸钠需要经过处理以后才能成为激活的矾酸钠,激活的矾酸钠才具有抑制去磷酸化的作用.原矾酸钠变成激活的矾酸钠的过程是:100mM原矾酸钠激活储存液配制(1).取0.183克的原矾酸钠溶解于10ml的双蒸水中,加酸调节PH至10(颜色变黄)(2).煮至无色(3).室温冷却(4).重调PH至10(5)重复()()()()直至溶液保持无色,并且稳定于10,分装100ul/管,每10ml裂解液加一管.(终浓度为1mM),-20度保存.使用: 贮存液:100mM 工作浓
9、度:1mMBETA-glycerophosphate 甘油磷酸钠溶解性:溶于水分子量:306.11使用:贮存液:100mM工作浓度:25mMNa2P2O4 焦磷酸钠溶解性:溶于水分子量:265.9贮存液:100mM, 工作浓度:1-2 mMSDS ,NP-40 ,TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。Brij Buffer I Tris-HCl (1M, pH 7.5)1millilitre (ml)EDTA (0.5 M)0.4millilitre (ml)NaCl (5M)3millilitre (ml)Brji 96 (10%)8.75millilitre (ml)NP40 (10%)1.25millilitre (ml)ddH2O to100millilitre (ml)Total volume100millilitre (ml)
限制150内