与氮素同化相关酶及测定方法讲稿.ppt
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1、关于与氮素同化相关酶及测定方法第一页,讲稿共二十九页哦自 然 界 中 N 素 循 环 第二页,讲稿共二十九页哦一、植物体内氮的含量与分布一、植物体内氮的含量与分布 含量:含量:占植物干重的占植物干重的0.35。植物种类:植物种类:豆科植物豆科植物非豆科植物非豆科植物品种:品种:高产品种高产品种低产品种低产品种器官:器官:种子种子叶叶根根茎秆茎秆第三页,讲稿共二十九页哦二、氮的生理功能二、氮的生理功能氮是蛋白质的重要成分(蛋白质含氮氮是蛋白质的重要成分(蛋白质含氮1618)2. 氮是核酸和核蛋白的成分(核酸中的氮约占植株全氮是核酸和核蛋白的成分(核酸中的氮约占植株全氮的氮的7)3. 氮是酶的成分
2、氮是酶的成分4.氮是叶绿素(叶绿素氮是叶绿素(叶绿素a:C55H72O5N4Mg)的成分(叶绿体的成分(叶绿体含蛋白质含蛋白质4560)第四页,讲稿共二十九页哦5. 氮是多种维生素的成分氮是多种维生素的成分:如维生素如维生素B1 (C12H17ON3S)、B2 (C17H18O6N4 )、B6(C6H11O3N) 6. 氮是一些植物激素的成分(如氮是一些植物激素的成分(如IAA、CTK)7. 氮也是生物碱的组分(如烟碱、茶碱、可可碱、咖啡氮也是生物碱的组分(如烟碱、茶碱、可可碱、咖啡碱、胆碱卵磷脂碱、胆碱卵磷脂(磷脂酰胆碱)磷脂酰胆碱)氮素通常被称为氮素通常被称为生命元素生命元素第五页,讲稿共
3、二十九页哦三、植物对氮的吸收三、植物对氮的吸收(adsorption)与同化与同化 (assimilation)吸收的形态吸收的形态无机态:无机态: NO3-N、NH4+N (主要)(主要)有机态:有机态:NH2 N、氨基酸、氨基酸、 核酸等核酸等(少量)(少量) 植物从外界环境获得植物从外界环境获得N主要是通过主要是通过 3条途径条途径, 通过通过NO3- 还原把无机氮转还原把无机氮转化为生命体可用的化为生命体可用的有机氮有机氮, 通过通过固氮菌固氮菌对对 N2的固定的固定, 直接吸收土壤中的直接吸收土壤中的铵或铵或有机氮有机氮。 植物的氮源主要是铵盐和硝酸盐,占土壤含氮的植物的氮源主要是铵
4、盐和硝酸盐,占土壤含氮的1%-2%。第六页,讲稿共二十九页哦(一)植物对硝态氮的吸收与同化(一)植物对硝态氮的吸收与同化1. 1. 吸收:吸收:旱地作物吸收旱地作物吸收NO3-N为主,为主,主动吸收主动吸收第七页,讲稿共二十九页哦2. 同化同化(1) NO3-N的还原作用的还原作用(nitrate reduction)过程:过程:NO3- NO2- NH3NR:硝酸还原酶硝酸还原酶(nitrate reductase)NiR:亚硝酸还原酶亚硝酸还原酶(nitrite reductase) NR,Mo NiR,Fe、Mn 根、叶细胞质根、叶细胞质 根、叶绿体根、叶绿体 第八页,讲稿共二十九页哦氨
5、的同化氨的同化 植物吸收铵盐以后,或当植物所吸收的硝酸盐被还原成植物吸收铵盐以后,或当植物所吸收的硝酸盐被还原成氨后,氨必须立即被同化成氨基酸,否则就会毒害植物。氨后,氨必须立即被同化成氨基酸,否则就会毒害植物。因为氨可能抑制呼吸过程中的电子传递系统。因为氨可能抑制呼吸过程中的电子传递系统。 氨的同化方式为:进入谷氨酸合成酶循环。氨的同化方式为:进入谷氨酸合成酶循环。 作用酶类:作用酶类: GOGAT: GOGAT:谷氨酸合成酶;存在于叶绿体。谷氨酸合成酶;存在于叶绿体。 GS: GS:谷氨酰胺合成酶;存在于叶绿体和细胞质中。谷氨酰胺合成酶;存在于叶绿体和细胞质中。 GDH: GDH:谷氨酸脱
6、氢酶;存在于线粒体中。谷氨酸脱氢酶;存在于线粒体中。第九页,讲稿共二十九页哦过程过程(1)GDH(谷氨酸脱氢酶)途径(谷氨酸脱氢酶)途径酮戊二酸氨谷氨酸各种新的氨基酸酮酸酰胺氨谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶转氨基作用转氨基作用第十页,讲稿共二十九页哦 (2 2)GS-GOGATGS-GOGAT途径途径 (谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶)(谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶) 是高等植物同化氨的主要途径是高等植物同化氨的主要途径第十一页,讲稿共二十九页哦谷氨酰胺合成酶COOHCHNH2CH2CH2CONH2COOHCHNH2CH2CH2COOH谷氨酸合成酶2H+,2eCOOHC=OCH2CH2COOHCOOHCH
7、NH2CH2CH2COOH谷氨酸脱氢酶NH4+吸收NO3还原N2固定光呼吸NH3NH3NADH谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸图图1 氨的同化途径的模式氨的同化途径的模式ATPNADH铁氧还蛋白 转氨基转氨基作用作用含氮化合物含氮化合物第十二页,讲稿共二十九页哦反应式:反应式:NH3谷氨酸谷氨酸ATP 谷氨酰胺谷氨酰胺ADPPi谷氨酰胺谷氨酰胺-酮戊二酸酮戊二酸2e2H 2谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸17酮酸酮酸 17种种氨基酸氨基酸 蛋白质蛋白质 谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶谷氨酸合成酶转氨酶转氨酶 合成合成 第十三页,讲稿共二十九页哦(transamination) (1)定义:是指一种-氨基
8、酸和氨基酸和-酮酸在转氨酶的作用下生成酮酸在转氨酶的作用下生成相应的相应的-酮酸和新的氨基酸的过程。酮酸和新的氨基酸的过程。(2)生物体内两种重要的转氨基作用)生物体内两种重要的转氨基作用谷丙转氨基作用谷丙转氨基作用谷草转氨基作用谷草转氨基作用第十四页,讲稿共二十九页哦谷丙转氨酶谷丙转氨酶( GPT)磷酸吡哆磷酸吡哆醛醛CHNH2CH3COOHCOOHCH2CH2C=OCOOHCOOHCH3C=OH-C-NH2COOHCH2CH2COOH+谷丙转氨基作用谷丙转氨基作用谷草转氨基作用谷草转氨基作用H-C-NH2COOHCH2COOH+COOHCH2CH2C=OCOOH谷草转氨酶(谷草转氨酶( G
9、OT)磷酸吡哆磷酸吡哆醛醛COOHCH2COOHC=OH-C-NH2COOHCH2CH2COOH+第十五页,讲稿共二十九页哦3. 酰胺酰胺(amide)的形成及意义的形成及意义形成:形成:NH3意义:意义:贮存氨基;贮存氨基; 解除氨毒;解除氨毒; 参与代参与代谢。谢。 谷氨酸谷氨酸(Glu) 酰胺合成酶酰胺合成酶 谷氨酰胺谷氨酰胺(Gln) 天门冬氨酸天门冬氨酸(Asp) ATP 天门冬酰胺天门冬酰胺(Asn) 铵态氮配方铵态氮配方第十六页,讲稿共二十九页哦非脲酶途径:非脲酶途径:直接同化直接同化尿素尿素 氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸 瓜氨酸瓜氨酸 精氨酸精氨酸(二)植物对有机氮的吸收与同化(二)植
10、物对有机氮的吸收与同化1. 尿素尿素 urea(酰胺态氮(酰胺态氮 amide nitrogen) (1) 吸收:吸收:根、叶均能直接吸收根、叶均能直接吸收(2) 同化:同化:脲酶途径:脲酶途径:尿素尿素 NH3 氨基酸氨基酸 脲酶脲酶水解水解尿素的毒害:尿素的毒害:当介质中尿素浓度过高时,植物会出现当介质中尿素浓度过高时,植物会出现受害症状受害症状第十七页,讲稿共二十九页哦2. 氨基态氮氨基态氮(amino nitrogen)可直接吸收,效果因种类而异可直接吸收,效果因种类而异第一类第一类 效果效果 硫酸铵:如甘氨酸、天门冬酰胺等硫酸铵:如甘氨酸、天门冬酰胺等第二类,第二类,尿素尿素 AA效
11、果效果 硫酸铵:如天门冬氨酸等硫酸铵:如天门冬氨酸等第三类,第三类,效果效果 尿素:如脯氨酸、缬氨酸等尿素:如脯氨酸、缬氨酸等第四类,第四类,有抑制作用:如蛋氨酸有抑制作用:如蛋氨酸第十八页,讲稿共二十九页哦植物转氨酶植物转氨酶(GOT和和GPT)活度比色测定方法及其应及活度比色测定方法及其应及GOGAT酶活性的测定酶活性的测定主要试剂主要试剂(1)0.05mol/L Tris-HCL缓冲液(pH7.2):0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷(24.2g三羟甲基氨基甲烷用蒸馏水溶解并定容至200ml)50ml和0.2mol/L HCl44.2ml,用蒸馏水稀释至200ml。(2)0.1mol/L磷
12、酸盐缓冲液:称取磷酸氢二钠 (AR)11.928g,磷酸二氢钾(AR)2.176g,加少量蒸馏水溶解并定容至1000ml。(3)2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/L HCL10ml溶解后,加蒸馏水至100ml,保存于棕色瓶中备用,此液可保存3个月。(4)0.4mol/L氢氧化钠溶液:16g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。第十九页,讲稿共二十九页哦(5)1mol/L氢氧化钠溶液:40g氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml。(6)丙酮酸标准液(2mol/ml):精确称取纯丙酮酸钠22.0mg于100ml容量瓶中,加0.1mol/
13、L磷酸盐缓冲液至刻度。此液应新鲜配制。(7)GOT底物液(DL-门冬氨酸200mmol/L,-酮戊二酸2mmol/L):称取-酮戊二酸29.2mg和DL-门冬氨酸2.66g置于一小烧杯中,加入1mol/L氢氧化钠20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后将溶液移入100ml容量瓶内,用0.1mol/L磷酸盐缓冲液定容至刻度。放置冰箱内保存。(8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,-酮戊二酸2mmol/L):称取-酮戊二酸29.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小烧杯中,加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)约80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氢氧化钠调pH至7.
14、4(约加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸盐缓冲液至100ml混匀,加氯仿数滴防腐,贮于冰箱内。第二十页,讲稿共二十九页哦1酶粗制剂的提取酶粗制剂的提取将 新 鲜 植 物 材 料 剪 碎, 取 鲜 重0 . 2 g左 右 放 入 研 钵, 加0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)2.0ml,在冰浴中研磨,得到的匀浆用高速离心机20000g离心20min,上清液供测酶活度用。2谷草转氨酶谷草转氨酶(GOT)活度测定活度测定取10ml试管2支,一支作测定管,分别加酶粗制剂0.1ml和GOT底物液0.5ml,另一支作对照管,仅加酶粗制剂0.1ml。将二管同时置37水浴,60min
15、后取出,各管加2,4二硝基苯肼液0.5ml终止反应,对照管再加GOT底物液0.5ml。将二管再置37水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L NaOH 5.0ml,混匀,10min后用分光光度计比色,波长500nm,蒸馏水调零点,读取吸光度。将测定管吸光度减去对照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml)。若查得的丙酮酸体积超过0.2ml时应将酶粗制液稀释后再进行测定,测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积V(ml)。第二十一页,讲稿共二十九页哦工作曲线绘制工作曲线绘制:取10ml试管5支,各管加0.1mol/L磷酸盐缓冲液0.1ml,分别加GOT底物液0.5、0.45、0
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- 氮素 同化 相关 测定 方法 讲稿
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