蛋白质免疫印迹实验(WesternBlot.ppt
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1、蛋白质免疫印迹实验 (Western Blotting),一 实验原理,Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。 首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离,然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上,这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体(称为第一抗体)为探针,与固体支持物上的蛋白质进行免疫反应,最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体(第二抗体)与第一抗体进行免疫反应,只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存在时就会出现颜色反应,结合
2、有第一抗体、第二抗体的待测蛋白,通过颜色反应即能显现出来。,一 实验原理,电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极,二者结合在一起,然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸结合,形成“三明治”结构,放入电转移仪器上,加入电泳缓冲液,通上电源后,蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。,一 实验原理,其定量关系符合以下公式: Ve=Vo+KV1 Ve:某一溶质的洗脱体积 Vo:层析柱的外水体积 Vi:层析柱的内水体积 K:某一溶质的分配系数,1试剂 电转移缓冲液 pH8.3 39mM甘氨酸 4.8mM Tris碱 0.037% SDS 2
3、0% 甲醇 混合2.9克甘氨酸,5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇,定容到1000ml. 封闭缓冲液:5%(W/V)脱脂奶粉溶于PBS中,二试剂和器材,1试剂 PBS: NaCl 8g,KCl 0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO4 0.24g 加双蒸水800ml,用HCl调pH到pH7.4,再加水到1000ml,分装后,15磅20分钟灭菌。 4-氯萘酚显色液:用30mg 4-氯萘酚(简称4-CN)溶于1ml无水乙醇中制成母液。将5014-CN对母液和5130%的H2O2加入到5ml 0.05M/L Tris-Cl(pH7.6)中。 氨基黑染色液:0.1%氨基黑1
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