免疫组织化学讲稿.ppt
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1、第一页,讲稿共六十页哦 免疫组织化学免疫组织化学(immunohistochemistry):将化学反应中将化学反应中呈色反应呈色反应与与免疫学免疫学抗原抗抗原抗体反应结合起来,用标记的特异性抗体(或体反应结合起来,用标记的特异性抗体(或抗原)对细胞及组织内抗原(或抗体)的分抗原)对细胞及组织内抗原(或抗体)的分布进行组织或细胞内布进行组织或细胞内原位检测原位检测的一门技术。的一门技术。第一节第一节 概概 述述 第二页,讲稿共六十页哦l从广义上理解:从广义上理解:免疫组织化学为组织化学的分支。免疫组织化学为组织化学的分支。l不同点:不同点:组织化学的局限性组织化学的局限性:只能识别细胞或组:只
2、能识别细胞或组织中核酸、蛋白质、酶、多糖、脂肪等,对织中核酸、蛋白质、酶、多糖、脂肪等,对免疫活化的大分子不能特异识别;方法上繁免疫活化的大分子不能特异识别;方法上繁锁,不易掌握。锁,不易掌握。第三页,讲稿共六十页哦 免疫组化的优点免疫组化的优点:能识别细胞或组织中蛋白质:能识别细胞或组织中蛋白质、脂、多糖类及小分子肽类。只要理论上具有、脂、多糖类及小分子肽类。只要理论上具有抗原性,可以制备出相应抗体,就可以示踪定抗原性,可以制备出相应抗体,就可以示踪定位,因此其待检物质广泛;方法上位,因此其待检物质广泛;方法上“一通百通一通百通”。第四页,讲稿共六十页哦第二节第二节 免疫组织化学的理论基础免
3、疫组织化学的理论基础 第五页,讲稿共六十页哦2.1.1 2.1.1 定义定义抗原抗原(antigen(antigen,Ag)Ag)是一类在合适条件下,能刺是一类在合适条件下,能刺激机体免疫系统发生免疫应答,并能与免疫应激机体免疫系统发生免疫应答,并能与免疫应答产生的效应物质(包括抗体和效应细胞)在答产生的效应物质(包括抗体和效应细胞)在体内和(或)体外发生特异性结合反应的物质体内和(或)体外发生特异性结合反应的物质,它具有,它具有免疫原性免疫原性和和反应原性反应原性。第六页,讲稿共六十页哦l免疫原性免疫原性指的是它能刺激机体免疫系统产指的是它能刺激机体免疫系统产生免疫应答;生免疫应答;l反应原
4、性反应原性指的是它能与抗体或致敏淋巴细指的是它能与抗体或致敏淋巴细胞特异性地结合而发生反应。胞特异性地结合而发生反应。第七页,讲稿共六十页哦 2.1.2 2.1.2 分类分类 完全抗原完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质兼有免疫原性和反应原性的物质称完全抗原。大多数蛋白质是良好的完全抗称完全抗原。大多数蛋白质是良好的完全抗原。原。半抗原半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原,绝大多数低分子量称半抗原或不完全抗原,绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属的多糖和所有的类脂均属半抗原半抗原。第八页,讲稿共六十页哦 2.1.3 2.1.3 抗原的特异
5、性抗原的特异性 抗原具有与相应抗体或致敏淋巴细胞发抗原具有与相应抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特异性。这是由抗原分子表面生反应的特异性。这是由抗原分子表面具有化学活性的基团具有化学活性的基团抗原决定簇抗原决定簇的性的性质、数目和空间构型决定的。抗原决定质、数目和空间构型决定的。抗原决定簇能被免疫活性细胞所识别,能与相应簇能被免疫活性细胞所识别,能与相应抗体的可变区结合。抗体的可变区结合。第九页,讲稿共六十页哦异种物质异种物质。如鸭血清蛋白对于兔为强抗。如鸭血清蛋白对于兔为强抗原,对于鸡则为弱抗原。原,对于鸡则为弱抗原。同种异体物质同种异体物质。如人类的。如人类的ABOABO血型的抗原血型的抗原物
6、质;物质;自身抗原自身抗原。如被血。如被血睾屏障所严密封睾屏障所严密封闭的精子所含的物质。闭的精子所含的物质。第十页,讲稿共六十页哦 2.2.1 2.2.1 定义定义 抗体抗体(antibody)(antibody)是机体在抗原物质刺激后,是机体在抗原物质刺激后,通过体液免疫应答,由浆细胞合成并分泌通过体液免疫应答,由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性地结合的球蛋白,的仅与该抗原发生特异性地结合的球蛋白,称免疫球蛋白称免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)(immunoglobulin,Ig),存在,存在于血液、淋巴液和组织液中。于血液、淋巴液和组织液中。第十一页,讲稿共六十页哦
7、2.2.2 2.2.2 结构结构抗体的基本结构由四条肽链对称排列组成,即两抗体的基本结构由四条肽链对称排列组成,即两条相同的重链和两条相同的轻链。条相同的重链和两条相同的轻链。可变区与稳定区可变区与稳定区第十二页,讲稿共六十页哦 第十三页,讲稿共六十页哦 抗原与抗体的结合具有抗原与抗体的结合具有高度特异性高度特异性,抗,抗体结合抗原的不同特异性,取决于轻链体结合抗原的不同特异性,取决于轻链和重链的可变区氨基酸的种类和顺序的和重链的可变区氨基酸的种类和顺序的不同。不同。2.2.3 2.2.3 特异性特异性第十四页,讲稿共六十页哦l目前,根据制备的原理和方法可分为目前,根据制备的原理和方法可分为多
8、多克隆抗体克隆抗体、单克隆抗体单克隆抗体及及基因工程基因工程抗体抗体三类三类。第十五页,讲稿共六十页哦 将一种天然抗原经各种途径免疫动物,将一种天然抗原经各种途径免疫动物,由于抗原性物质具有多种决定簇,故可刺由于抗原性物质具有多种决定簇,故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆,合成和分激产生多种抗体形成细胞克隆,合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清中,故泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清中,故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物,在其血清中实际上是含多种抗体的混合物,称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体(多数抗血清系由家兔制得)多克隆抗体(多数抗血清系由家
9、兔制得)。第十六页,讲稿共六十页哦 由识别一种抗原决定簇的细胞克隆由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体,称为单克隆抗体,所产生的均一性抗体,称为单克隆抗体,具有特异性强、纯度高的特点。应用杂具有特异性强、纯度高的特点。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体(多数单克隆抗体由小鼠制备)。抗体(多数单克隆抗体由小鼠制备)。第十七页,讲稿共六十页哦 将对基因结构与功能的了解与将对基因结构与功能的了解与DNADNA重重组技术相结合,根据研究者的意图在基组技术相结合,根据研究者的意图在基因水平对分子进行切割、拼接或修饰,因水平对分子进行切割、拼接或修饰
10、,甚至是人工全合成后导入受体细胞表达,甚至是人工全合成后导入受体细胞表达,产生新型抗体。产生新型抗体。第十八页,讲稿共六十页哦第十九页,讲稿共六十页哦l19411941年年CoonsCoons建立了荧光素标记肺炎双球建立了荧光素标记肺炎双球菌粘多糖抗体。菌粘多糖抗体。l6060年代年代NakaneNakane建立了酶标记抗体技术建立了酶标记抗体技术第二十页,讲稿共六十页哦 直接用荧光素或辣根过氧化物酶直接用荧光素或辣根过氧化物酶标记特异标记特异性抗体性抗体,与组织切片中相关抗原结合,用,与组织切片中相关抗原结合,用荧光荧光/普通显微镜识别荧光所在的部位或酶普通显微镜识别荧光所在的部位或酶显色的
11、部位,以确定抗原所在的部位。该显色的部位,以确定抗原所在的部位。该方法简单,但购买标记特异性抗体较困难,方法简单,但购买标记特异性抗体较困难,目前已经较少使用。目前已经较少使用。第二十一页,讲稿共六十页哦第二十二页,讲稿共六十页哦直接标记法直接标记法第二十三页,讲稿共六十页哦 将未标记的特异抗体(第一抗体)与组将未标记的特异抗体(第一抗体)与组织中抗原相结合,为了观察其结合部位,织中抗原相结合,为了观察其结合部位,用荧光素或用荧光素或HRPHRP标记第二抗体即标记在抗标记第二抗体即标记在抗第一抗体的免疫球蛋白上再与第一抗体结第一抗体的免疫球蛋白上再与第一抗体结合,如第一抗体为兔血清,第二抗体必
12、须合,如第一抗体为兔血清,第二抗体必须为其他动物抗兔的免疫球蛋白抗体。为其他动物抗兔的免疫球蛋白抗体。第二十四页,讲稿共六十页哦 间接标记法间接标记法第二十五页,讲稿共六十页哦优点:优点:只要不同的第一抗体均来自同一种属,同标记的只要不同的第一抗体均来自同一种属,同标记的第二抗体结合就能用来显示其不同特异性抗原的存在,第二抗体结合就能用来显示其不同特异性抗原的存在,这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦,这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦,并且提高了方法的敏感度。并且提高了方法的敏感度。缺点:缺点:酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性、酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体
13、和酶的活性、抗血清中的非特异性抗体被酶标记后,与组织成分结合,抗血清中的非特异性抗体被酶标记后,与组织成分结合,可致背景染色等。可致背景染色等。第二十六页,讲稿共六十页哦 第二十七页,讲稿共六十页哦第二十八页,讲稿共六十页哦l7070年代年代SternbergerSternberger改良并建立了辣根过改良并建立了辣根过氧化物酶氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法(抗过氧化物酶复合物法(PAPPAP)技术。技术。第二十九页,讲稿共六十页哦 辣根过氧化物酶(辣根过氧化物酶(HRPHRP)是从辣根中提取的,)是从辣根中提取的,分子量为分子量为4000040000,等电点,等电点3 39 9,最适,最适P
14、HPH为为5 5,它的底物是它的底物是3 3,3-3-二氨基联苯胺(二氨基联苯胺(DABDAB),HRPHRP使使DABDAB氧化形成氧化形成棕黄色产物棕黄色产物,可在光镜和,可在光镜和电镜下观察。电镜下观察。HRPHRP DAB+H DAB+H2 2O O2 2 棕黄色产物棕黄色产物第三十页,讲稿共六十页哦PAPPAP法基本原理法基本原理:第三十一页,讲稿共六十页哦v卵白素(卵白素(AvidinAvidin):又称抗生物素、亲和素,又称抗生物素、亲和素,具有具有4 4个与生物素亲和力极强的结合点。个与生物素亲和力极强的结合点。v链霉亲和素(链霉亲和素(strept avidinstrept
15、avidin)是一种从链是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质,霉菌培养物中提取的蛋白质,和亲和素一和亲和素一样,也有样,也有4 4个生物素结合位点。个生物素结合位点。v生物素(生物素(BiotinBiotin):维生素维生素H H,是一种小分,是一种小分子的维生素。子的维生素。第三十二页,讲稿共六十页哦l抗生物素具有抗生物素具有4 4个与生物素亲和力极强的结合点,这种亲个与生物素亲和力极强的结合点,这种亲和力较抗原抗体的亲和力高和力较抗原抗体的亲和力高100100万倍,而且不影响彼此万倍,而且不影响彼此的生物学活性,同时生物素与抗生物素都具有与其他的生物学活性,同时生物素与抗生物素都具有与其他示
16、踪物质如荧光素、铁蛋白和示踪物质如荧光素、铁蛋白和HRPHRP相结合能力,由此建相结合能力,由此建立了抗生物素生物素免疫染色系统,包括抗生物素立了抗生物素生物素免疫染色系统,包括抗生物素生物素过氧化酶复合物技术(生物素过氧化酶复合物技术(ABCABC)及链霉亲合素)及链霉亲合素生物素过氧化酶(或碱性磷酸酶)合复技术生物素过氧化酶(或碱性磷酸酶)合复技术(SABCSABC)。)。第三十三页,讲稿共六十页哦第三十四页,讲稿共六十页哦第三十五页,讲稿共六十页哦l标记链霉抗生物素生物素法,又称链标记链霉抗生物素生物素法,又称链霉亲合素酶结合法(霉亲合素酶结合法(strepavidin strepavi
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