单克隆抗体和基因工程抗体制备.ppt
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1、关于单克隆抗体和基因工程抗体的制备第一张,PPT共六十八页,创作于2022年6月目的要求目的要求1.掌握杂交瘤技术的基本原理掌握杂交瘤技术的基本原理2.熟悉单克隆抗体的制备技术熟悉单克隆抗体的制备技术3.熟悉基因工程抗体技术熟悉基因工程抗体技术第二张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 大多数抗原分子具有多个抗原决定簇大多数抗原分子具有多个抗原决定簇(表位,(表位,epitope)。一个抗原决定簇刺)。一个抗原决定簇刺激一个激一个B细胞克隆产生一种特异性抗体,细胞克隆产生一种特异性抗体,一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体(克隆抗体(polyclon
2、al antibody,PcAb)如免疫血清。由一个只识别一种抗原表位如免疫血清。由一个只识别一种抗原表位的的B细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体体(monoclonal antibody,McAb)。概概 述述第三张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 单克隆抗体理化性状高度均一,其抗原结单克隆抗体理化性状高度均一,其抗原结合部位完全相同,生物活性专一,特异性强,合部位完全相同,生物活性专一,特异性强,纯度高,效价高,易于实验标准化及大量制备,纯度高,效价高,易于实验标准化及大量制备,是研究抗体的一重大突破。应用比较广,如试是研究抗体的一重大突破。应用
3、比较广,如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植及自身免疫病剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植及自身免疫病等。等。第四张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 第一节第一节 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 基基本本原原理理是是融融合合的的两两种种细细胞胞保保持持自自身身的的特特性性,产产生生具具有有原原来来两两个个细细胞胞基基因因信信息息的的单单个个核核细细胞胞称称为为杂杂交交细细胞胞。包包括括B细细胞胞、T细细胞胞,前前者者产产生生Ig,后后者者产生产生CK。第五张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 一、B 淋巴细胞杂交瘤技术 细细胞胞是是经经抗抗原原免免疫疫的的小小鼠鼠脾脾细细胞胞和和
4、小小鼠鼠骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞。B B细细胞胞能能产产生生抗抗体体,但但不不能能在在体体外外长长期期生生长长,而而骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞不不产产生生抗抗体体但但在在体体外外能能长长期期生生长长,二二者者融融合合,各保持其本性,既产生抗体又长期生长。各保持其本性,既产生抗体又长期生长。其原理分为几个步骤其原理分为几个步骤第六张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 目目的的是是制制备备抗抗原原特特异异的的 McAbMcAb,所所以以融融合合的的细细胞胞必必须须经经抗抗原原免免疫疫的的B B细细胞胞,通通常常取取脾脾,另另一一是是在在体体外外长长期期生生长长又又不不产产生生抗抗体体,所所以以选选肿肿
5、瘤瘤细细胞胞即即多多发发性性骨骨髓髓瘤细胞,具备以下特点:瘤细胞,具备以下特点:(一)细胞的选择与融合第七张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 1.1.稳定、易培养稳定、易培养 2.2.自身不分泌自身不分泌IgIg或或CKCK 3.3.融合率高融合率高 4.4.是是HGPRTHGPRT缺陷株缺陷株 第八张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 目目前前常常用用的的BALB/cBALB/c小小鼠鼠B B细细胞胞瘤瘤株株有有P3-P3-X63-Ag8.653CX63-Ag8.653C(P3.653P3.653)、Sp2Sp2/0 0等等。为为HATHAT敏敏感感株株,易易培培养养,融融合合
6、率率高高,最最常常选选用用聚聚乙乙二二醇醇(PEG)(PEG)使细胞膜轻度损伤,细胞容易融合。使细胞膜轻度损伤,细胞容易融合。第九张,PPT共六十八页,创作于2022年6月(二)选择培养基的应用(二)选择培养基的应用 细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能出现以下情况出现以下情况:1 1)脾细胞与瘤细胞)脾细胞与瘤细胞 2 2)瘤细胞与瘤细胞)瘤细胞与瘤细胞 3 3)脾细胞与脾细胞)脾细胞与脾细胞 4 4)未融合的脾细胞)未融合的脾细胞 5 5)未融合的瘤细胞)未融合的瘤细胞 6 6)多聚体形式。)多聚体形式。3 3)、)、4 4)、)、6 6)在体外
7、易死去,不需筛选。)在体外易死去,不需筛选。第十张,PPT共六十八页,创作于2022年6月第十一张,PPT共六十八页,创作于2022年6月细胞的细胞的 DNA 合成一般有两条途径合成一般有两条途径 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,进一步合成成核苷酸,进一步合成 DNA,叶酸是重要,叶酸是重要辅酶。辅酶。一是辅助途径,是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶一是辅助途径,是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶存在下,经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶存在下,经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(hypoxanthine guanine phospheribosyl hypoxanthine guanine
8、 phospheribosyl transferase,HGPRTtransferase,HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶)和胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase,TKthymidine kinase,TK)的催化作用)的催化作用合成合成 DNA。第十二张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂,当氨基蝶呤存氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂,当氨基蝶呤存在时,能阻断第一条途径。细胞融合的选择在时,能阻断第一条途径。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分,次黄嘌呤培养基中有三种关键成分,次黄嘌呤(hypoxanthine,H)(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤、氨
9、基蝶呤(aminopoterin,A)(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)(thymidine,T),三者取前缀缩写为,三者取前缀缩写为 HAT HAT 培培养基,其融合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基,其融合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基选择出来的养基选择出来的 HGPRT HGPRT 阴性细胞株。阴性细胞株。第十三张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 所以,前面提到的所以,前面提到的 2)瘤细胞与瘤细胞及)瘤细胞与瘤细胞及 5)未融合的瘤细胞不能生长,只有未融合的瘤细胞不能生长,只有 1)脾细胞与)脾细胞与瘤细胞才能生长,因为脾细胞为瘤
10、细胞才能生长,因为脾细胞为 HGPRT 阳性,阳性,通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。第十四张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 (三)有限稀释与抗原特异性选择(三)有限稀释与抗原特异性选择 在在免免疫疫动动物物时时,一一种种抗抗原原往往往往有有多多个个表表位位 ,一一个个B B细细胞胞克克隆隆接接受受一一个个表表位位,故故在在免免疫疫动动物物时时是是众众多多 B B 细细胞胞克克隆隆的的抗抗体体的的分分泌泌,而而针针对对目目的的抗抗原原的的B B细细胞胞只只占占很很少少部部分分,在在细细胞胞融融合合后后,有有相相当当一一部部分分是是无无关关
11、的的细细胞胞融融合合体体,即即融融合合细细胞胞分分泌泌的的不不是是目目的的抗抗体体,要要进进行筛选,分二步稀释。行筛选,分二步稀释。第十五张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 计计数数,每每个个孔孔只只放放一一个个细细胞胞,实实际际是是0至至数数个个,整整个个过过程程为为克克隆隆化化,将将阳阳性性细细胞胞株株重重复复一一次次,尽尽量量使使抗抗体体更更纯纯,将将阳阳性性细细胞胞进进行行增增殖殖,部分冻存,部分进行体外培养或动物接种。部分冻存,部分进行体外培养或动物接种。第十六张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 另外还有其他杂交瘤技术,如人另外还有其他杂交瘤技术,如人-人人 B B
12、淋巴细胞杂交瘤和鼠淋巴细胞杂交瘤和鼠-人人 B B 淋巴细胞杂交瘤,淋巴细胞杂交瘤,人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难,生长不稳人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难,生长不稳定,有的分泌定,有的分泌 IgEIgE,有的分泌,有的分泌 Ig Ig 的的、链。链。B B细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细胞。从理论上讲很好,胞、病灶浸润性淋巴细胞。从理论上讲很好,但实际比较困难,在于缺乏好的亲体骨髓瘤细但实际比较困难,在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株,较难获得抗原特异性胞株,较难获得抗原特异性B B淋巴细胞;人杂淋巴细胞;人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动
13、物体内生长。交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长。第十七张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 小鼠骨髓瘤与人的小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤,该技术细胞杂交瘤,该技术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞,融合率较高,优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞,融合率较高,但最大的缺点是不同种杂交后不稳定,杂交瘤但最大的缺点是不同种杂交后不稳定,杂交瘤传代后,很快丧失分泌抗体的染色体。传代后,很快丧失分泌抗体的染色体。第十八张,PPT共六十八页,创作于2022年6月二、二、T 细胞杂交瘤细胞杂交瘤 自自 B B 细胞杂交瘤技术后,细胞杂交瘤技术后,T T 淋巴细胞杂交淋巴细胞杂交瘤成为热门,为获得淋巴因子,更深入地研
14、瘤成为热门,为获得淋巴因子,更深入地研究究T T细胞的各种功能,虽然有一些小鼠细胞的各种功能,虽然有一些小鼠T T细胞细胞杂交瘤成功的报道,但结果不满意,该细胞很杂交瘤成功的报道,但结果不满意,该细胞很不稳定,分泌淋巴因子无特异性,一种不稳定,分泌淋巴因子无特异性,一种T T细胞杂细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子,到目前仍无突交瘤可同时分泌几种淋巴因子,到目前仍无突破性进展。破性进展。第十九张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 T T 淋淋巴巴细细胞胞杂杂交交瘤瘤分分为为小小鼠鼠及及人人,由由于于 T T 细细胞胞功功能能的的多多样样化化,制制备备出出的的 T T 细细胞胞杂杂交交瘤瘤也
15、也各各有有其其特特性性,如如分分泌泌淋淋巴巴因因子子,特特异异性性杀杀伤伤功功能能,分分泌泌抑抑制制因因子子,自自身身反反应应性性等等。其其基基本本过过程程是是将将激激活活的的T T细细胞胞与与酶酶缺缺陷陷型型T T淋淋巴巴细细胞胞瘤瘤细细胞胞融融合合,可可表表达达特特异异性性 TCR TCR 或或其其他他功功能能的的杂杂交交瘤瘤T T细细胞胞,与与 B B 细细胞胞相相以以,但但细细胞胞激激活活和和阳阳性性克克隆隆筛筛选选较较为为杂杂交交,不不稳稳定定,简简介介主主要要步步骤骤 。第二十张,PPT共六十八页,创作于2022年6月1.1.淋巴瘤细胞系的选择淋巴瘤细胞系的选择1 1)体外无限制快
16、速生长)体外无限制快速生长2 2)融合率高)融合率高3 3)不分泌淋巴因子和杀伤功能)不分泌淋巴因子和杀伤功能4 4)缺乏某一特异性表面抗原或受体)缺乏某一特异性表面抗原或受体5 5)HGPRT HGPRT 酶缺陷型酶缺陷型第二十一张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 2.2.特特异异性性T T细细胞胞的的制制备备与与纯纯化化主主要要有有可可溶溶性性抗抗原原诱诱导导激激活活的的 T T 细细胞胞、同同种种反反应应性性T T 细胞、人的特异性细胞、人的特异性 T T 细胞。细胞。第二十二张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 3.T 3.T 细胞杂交瘤的筛选细胞杂交瘤的筛选 通通常常在
17、在含含有有HATHAT选选择择培培养养基基上上,用用特特异异性性抗抗体体筛筛选选产产生生淋淋巴巴因因子子的的杂杂交交瘤瘤细细胞胞,用用抗抗 CD3-TCR CD3-TCR 抗抗体体筛筛选选阳阳性性细细胞。胞。第二十三张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养 杂杂交交瘤瘤细细胞胞形形成成的的初初期期很很不不稳稳定定,鼠鼠的的二二倍倍体体细细胞胞有有4040对对染染色色体体,杂杂交交后后8080对对,易易丢丢失失,丢丢失失后后仍仍生生长长,要要检检测测上上清清液液中中是否有目的抗体及淋巴因子。是否有目的抗体及淋巴因子。第二十四张,PP
18、T共六十八页,创作于2022年6月 将阳性细胞进行单细胞培养,反复将阳性细胞进行单细胞培养,反复23次,次,确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻存,确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻存,以防止细胞染色体丢失,发生变异或污染,冻以防止细胞染色体丢失,发生变异或污染,冻存于液氮(存于液氮(-196),冻存时加小牛血清至冻存时加小牛血清至20%,加几滴加几滴10%二甲亚砜。二甲亚砜。杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种动杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种动物腹腔。物腹腔。第二十五张,PPT共六十八页,创作于2022年6月第二节第二节 单克隆抗体的制备技术单克隆抗体的制备技术 McAb McAb
19、单单一一、特特异异、纯纯化化,利利用用杂杂交交瘤瘤技术制备技术制备McAbMcAb的基本原理是三个原则:的基本原理是三个原则:1 1)一种单克隆产生一种抗体)一种单克隆产生一种抗体 2 2)杂交瘤细胞保持双亲细胞特性)杂交瘤细胞保持双亲细胞特性 3 3)筛选培养基)筛选培养基第二十六张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 一、单克隆抗体的产生一、单克隆抗体的产生 1.1.动物体内生长动物体内生长 杂杂交交瘤瘤细细胞胞注注射射同同系系小小鼠鼠腹腹腔腔,先先注注射射石石蜡蜡或或不不完完全全佐佐剂剂,使使腹腹腔腔渗渗出出液液增增多多,1 12 2周后无菌方法抽取腹水,离心取上清。周后无菌方法抽取
20、腹水,离心取上清。第二十七张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 2.2.体外培养体外培养 较常做,用普通培养瓶培养,根据培养时较常做,用普通培养瓶培养,根据培养时间、细胞生长情况收取上清液。另有高密度培间、细胞生长情况收取上清液。另有高密度培养,在单位体积内增加细胞的培养数量。养,在单位体积内增加细胞的培养数量。第二十八张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 二、单克隆抗体的纯化二、单克隆抗体的纯化 腹水或细胞上清液,均含有脂蛋白、脂质及细腹水或细胞上清液,均含有脂蛋白、脂质及细胞碎片等杂质,用滤纸去掉脂质和大颗粒,离心去胞碎片等杂质,用滤纸去掉脂质和大颗粒,离心去除细胞碎片和蛋白聚
21、合物。除细胞碎片和蛋白聚合物。第二十九张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 目前纯化方法有十几种,一般采用盐析、凝目前纯化方法有十几种,一般采用盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等,现在最有胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等,现在最有效的方法是亲和纯化法,常用效的方法是亲和纯化法,常用 SPA 或抗小鼠免或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联。称为疫球蛋白抗体与载体交联。称为 Sepharose 柱,柱,抗体结合上去,然后洗脱。抗体结合上去,然后洗脱。第三十张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 三、单克隆抗体的性质鉴定三、单克隆抗体的性质鉴定 鉴定的方法很多,用已知抗原测定鉴定的方法很
22、多,用已知抗原测定抗体,几乎所有的抗原抗体反应试验抗体,几乎所有的抗原抗体反应试验都可以作,如阳性,再定量,确定工都可以作,如阳性,再定量,确定工作浓度。作浓度。第三十一张,PPT共六十八页,创作于2022年6月第三节第三节 基因工程抗体技术基因工程抗体技术 杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯应用中非常广泛,但预防和蛋白质提纯应用中非常广泛,但对人是异源性,人抗小鼠抗体,应用基对人是异源性,人抗小鼠抗体,应用基因工程技术减少小鼠源成分,保留原有因工程技术减少小鼠源成分,保留原有的抗体特异性。的抗体特异性。第三十二张,PPT共六十八页,创作于2022年6
23、月一、人源化抗体一、人源化抗体 人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的基因克隆及基因克隆及 DNA DNA 重组技术改造,重新表重组技术改造,重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所取代,既基本保留亲代鼠单克隆序列所取代,既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和力和特异性,又降低了鼠异抗体的亲和力和特异性,又降低了鼠异源性。源性。第三十三张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 (一)人(一)人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体 通过基因工程技术将人通过基因工程技术将人 IgG C IgG C 区与区与鼠鼠IgG IgG V V 区连接,导入
24、细胞内表达制备的抗体称为嵌合区连接,导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体,因抗体,因 IgG IgG 的抗原性在的抗原性在 C C 区,来自人,故区,来自人,故抗原性降低,且半衰期明显延长,在介导抗原性降低,且半衰期明显延长,在介导 CDC CDC 及及 ADCC ADCC 亦明显增强。亦明显增强。第三十四张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 1.1.鼠单克隆抗体可变区基因克隆鼠单克隆抗体可变区基因克隆 用用探探针针从从该该杂杂交交瘤瘤细细胞胞的的基基因因组组文文库库中中调调取取。用用 PCR PCR 方方法法从从该该细细胞胞的的 RNA RNA 中中扩增扩增 V VH H 及及 V V
25、L L 基因。基因。第三十五张,PPT共六十八页,创作于2022年6月 2.2.表达载体的构建表达载体的构建 人人-鼠鼠嵌嵌合合抗抗体体的的表表达达载载体体基基因因依依可可变变区区基基因因克克隆隆的的表表达达方方式式不不同同而而分分为为两两类类,从从基基因因文文库库所所克克隆隆的的可可变变区区基基因因带带有有上上游游的的转转录录调调控控组组件件及及内内含含子子剪剪接接信信号号,因因此此载载体体只只需需要要包包括括细细胞胞内内增增殖殖所所必必须须的的抗抗生生素素抗抗性性基基因因和和质质粒粒复复制制的的起起始始序序列列以以及及在在真真核细胞进行选择的显性标记基因。核细胞进行选择的显性标记基因。第三
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- 单克隆抗体 基因工程 抗体 制备
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