人参内生真菌的分离及其抗肿瘤活性研究_王卓.docx
《人参内生真菌的分离及其抗肿瘤活性研究_王卓.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《人参内生真菌的分离及其抗肿瘤活性研究_王卓.docx(4页珍藏版)》请在得力文库 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、 DOI: 10.13313/j .issn. 1673-4890.2013.09.019 人参内生真菌的分离及其抗肿瘤活性研究 王卓 于慧美 2,刘鼎、高微 2,田义新 (1.吉林农业大学中药材学院,吉林长春 130033; 2.吉林大学白求恩医学院,吉林长春 130021) 0商要 目的:从人参中分离获得人参内生真菌,并初步探讨其代谢产物粗提物的抗肿瘤活性。方法:研宄 利用筛选培养基从 6年生人参中分离内生真菌,并利用小琼脂块培养法和分子生物学方法对获得的人参内生真菌进 行鉴定,利用 MTT法检测其体外抗肿瘤活性。结果:从人参中共计分离得到内生真菌 28株,其中 2株活性较好。 结论:从药
2、用植物人参中分离得到的人参内生真菌具有潜在的抗肿瘤活性,为进一步开发抗肿瘤药物提供新的研宄 对象。 关键词 人参;内生真菌;分离;生物活性;抗肿瘤 人参 Pa/iax C. A. Meyer为五加科人参属 植物,以干燥根及根茎入药,始载于神农本草 经,具有大补元气,复脉固脱,补脾益肺,生津养 血,安神益智功能,是吉林省的道地药材 &。众所 周知,人参是传统的名贵药材,含有丰富的人参皂 苷、多种氨基酸、多糖及挥发油等成分,对人体的 中枢神经系统、心血管系统、免疫系统及泌尿生殖 系统等具有广泛的作用,能增强机体对有害刺激的 抵抗力3_5。 内生真菌是生活于健康植物的组织细胞间或细 胞内,且不会造成
3、明显疾病症状的真菌 6。目前的 研宄发现,从多种植物中都可以分离获得内生真 菌 7。在自然生态系统中,生活在健康植物内部组 织的内生真菌与宿主表现出复杂的相互作用,两者 建立了一个和谐的共生系统并从中受益。植物内生 真菌可以产生丰富的代谢产物,其中很多与宿主植 物的代谢产物相同或相类似,因此 己成为寻找天然 药物的重要来源。如今,有关植物内生菌的研宄报 道有很多,但是关于人参内生真菌的相关研宄却相 对较少。 作者从药用植物人参中分离获得人参内生真菌, 并进行体外抗肿瘤活性研宄,结果显示,人参内生 真菌代谢产物具有潜在的抗肿瘤活性,这为进一步 开发抗肿瘤药物提供了新的研宄对象。 1材料 1.1植
4、物材料及细胞株 人参于 2012年 10月 18日采自吉林省抚松县二 道河镇人参生产基地, 6年生;人宫颈癌细胞株 (Hela)保存于吉林农业大学中药材学院。 1.2真菌培养基及细胞培养液 真菌分离、鉴定的培养基包括 PDA固体培养 基、DRBC培养基(含氯霉素、链霉素等细菌抗生 素)、PDB液体培养液;细胞培养液采用含 10%小 牛血清的IMDM培养液。 2方法 2.1植物内生真菌的分离 挑取新鲜人参,去掉泥土、芦头、参须等后, 用蒸馏水冲洗干净。在超净工作台中用 75%乙醇 浸泡 1 min,然后用 5 % NaCIO溶液浸泡 5 min, 再用 75%乙醇浸泡 30 s, 最后用无菌水冲
5、洗 4 次;用无菌的滤纸吸干人参表面的水分,用消过 毒的手术刀片将人参切成 5 mm X 5 mm X 5 mm见 方的小块 接种于 DRBC培养基上,每个培养皿中 接种数个小块,每个小块间隔距离大于 3 cm, 置 于 28 T培养箱中培养。待观察到从植物小块内 部长出真菌菌丝时,将其转移到新的PDA培养基 上继续培养。 M讯作者 田义新, Tel: (0431) 84533304, E-mail: y. X. tian2003 163. (.om 2.2植物内生真菌的鉴定 利用小琼脂块培养法和分子生物学方法对分离 的植物内生真菌进行鉴定。小琼脂块接种真菌菌丝 及孢子,于 28 C培养箱中培
6、养,随时观察真菌生长 情况,根据菌丝、孢子生长情况对真菌进行归属鉴 定;提取真菌基因组 DNA, 利用 ITS通用引物,扩 增真菌的 ITS基因序列,扩增产物测序后通过与 NCBI序列数据库进行同源性比对后,对其归属进行 进一步的鉴定 s。 2.3植物内生真菌代谢产物粗体物的提取 于 1 L培养瓶中接种 300 mL PDB液体培养液, 将分离出的人参内生真菌接种于培养液中,置于 28 C摇床中培养 15 d。 采用四层纱布过滤除去菌丝 体,获得的滤液采用乙酸乙酯萃取 3次,合并萃取 液并浓缩,旋转蒸发为干粉, 即为乙酸乙酯粗提物, 称重。 2.4植物内生菌抗肿瘤活性研究 乙酸乙酯粗提物经二甲
7、基亚砜 ( DMS0)溶解 后,用 PBS以倍比稀释法稀释粗提物。采用 MTT法 测定粗提物的抗肿瘤活性。 96孔板中按 1 x 104每孔 接种细胞, 37丈, 5% C02细胞培养箱培养 20 24 h。 待细胞融合率达到 80%,加入不同浓度的乙 酸乙酯粗提物,于细胞培养箱中继续培养 24 h, 每孔 中加入20 |xL 5 mg.mL 1的 MTT作用 4 h, 吸净培养 液,加入 100 JJX DMS0溶解形成的甲臜 ( fomiazan), 于 570 nm测定吸光度值。 2.5数据统计分析 利用 SPSS17. 0软件对数据结果进行方差分析。 3结果 3.1人参内生真菌分离、鉴
8、定 经过在 DRBC培养基上 4 21 d的培养,共从 人参组织块中分离出人参内生真菌 28株,利用小琼 脂块培养法和分子生物学方法对获得的人参内生真 菌进行鉴定。结果显示,人参中包含的真菌包括镰 刀菌、毛霉、木霉、地霉、青霉等。其中,镰刀菌 为人参内生真菌中的优势种群,占到分离获得的人 参内生真菌总数的 46. 4%,见表 1。 3.2人参内生真菌抗肿瘤活性研宄 将从人参内生真菌组织块中分离出的 28株人 参内生真菌置于 PDB液体 28丈摇床中发酵培养 15 d后,经纱布过滤除去菌丝体,获得的滤液采用 乙酸乙酯萃取,旋转蒸发后浓缩为干粉, DMS0 溶解。 MTT检测结果发现 , DMS0
9、 终 浓 度 为 1 x 10_5 mmol*L一,对细胞生存率无影响。 28株人参内生真 菌乙酸乙酯粗提物中有两株对人宫颈癌 Hela细胞的 IC5。达到 60 140 fjLg.mL 1 (见图 1)。综合前人的研 究结果,这两株内生真菌粗提物的抗肿瘤活性较理 想,可进行进一步的分离纯化,以分析获得其抗肿 瘤活性。 表 1人参内生真菌的分离鉴定 菌株 种属 同源性 /% GS4 尖孢镰刀菌 98 GS4 镰刀菌 99 GS-3 烟曲霉 97 GS4 半裸镰刀菌 98 GS-5 毛霉 99 GS-6 烟曲霉 98 GSJ 镰刀菌 98 GS-8 烟曲霉 99 GS-9 未知 1 99 GS4
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 人参 真菌 分离 及其 肿瘤 活性 研究 王卓
限制150内