亲合组织化学技术讲稿.ppt
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1、亲合组织化学技术第一页,讲稿共二十七页哦发展历史发展历史v6060年代:发现生物素和卵白素年代:发现生物素和卵白素v7070年代:植物凝集素、生物素、葡萄球菌年代:植物凝集素、生物素、葡萄球菌A A蛋白蛋白-BRAB-BRAB、LABLAB、SPA-HRPSPA-HRP、ABCABCv亲和组织化学:亲和组织化学:19761976年年BayerBayer首次提出首次提出 包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌包括植物凝集素和糖类、生物素和抗生物素、葡萄球菌A A蛋白与蛋白与IgGIgG、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位和、阳离子与阴离子、激素、维生素、糖及类脂质作用部位
2、和受体等受体等第二页,讲稿共二十七页哦植物凝集素植物凝集素(Lectin)(Lectin)生物素生物素(Biotin)(Biotin)葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白蛋白(SPA)(SPA)SPASPAHRPHRP法、法、ABCABC法和法和LABLAB法等。法等。亲合组织化学技术亲合组织化学技术v定义:定义:是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础,建是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础,建立的组织细胞基础化学技术。立的组织细胞基础化学技术。v本质:本质:区别于一般的组织化学,非抗原抗体反应。区别于一般的组织化学,非抗原抗体反应。v优点:优点:敏感性高,有利于微量抗原(或抗体)在细
3、胞或亚细敏感性高,有利于微量抗原(或抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。胞水平的定位。第三页,讲稿共二十七页哦一一 抗生物素抗生物素生物素免疫细胞化学技术生物素免疫细胞化学技术 二二 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A技术技术 三三 凝集素组织化学技术凝集素组织化学技术四四 其它亲和细胞化学其它亲和细胞化学第四页,讲稿共二十七页哦一、抗生物素一、抗生物素生物素免疫细胞化学技术生物素免疫细胞化学技术 (一一)基本原理基本原理 亲合素(抗生物素亲合素(抗生物素/卵白素)卵白素)是是鸡鸡蛋蛋白白中中含含有有的的一一种种碱碱性性蛋蛋白白,属属于于糖糖蛋蛋白白;具具有有4 4个个同同维维生生素素H H(生生物物
4、素素)亲亲合合力力极极高高的结合点。的结合点。链酶亲合素链酶亲合素 是是一一种种从从链链酶酶菌菌培培养养物物中中提提取取的的蛋蛋白白质质,和和亲亲合合素素一一样样,也也有有四四个个生生物物素素结结合合位位点点,是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。是一种亲和力更高的生物素结合蛋白。生物素(维生素生物素(维生素H H)是一种小分子的水溶性维生素,它与亲合素链酶亲合素之间有很强的亲合是一种小分子的水溶性维生素,它与亲合素链酶亲合素之间有很强的亲合力,较之抗体对抗原的亲合力要高出力,较之抗体对抗原的亲合力要高出100100万倍,能够彼此牢固结合而不影响万倍,能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。彼此
5、的生物学活性。生物素、亲合素、链酶亲合素:生物素、亲合素、链酶亲合素:能与荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合。能与荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合。亲亲合合素素、链链酶酶亲亲合合素素:同同一一定定浓浓度度的的生生物物素素化化酶酶混混合合后后,形形成成亲亲合合素素一一生生物物素素一一酶酶复复合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。合物。这种复合物可以和各种生物素标记抗体结合。第五页,讲稿共二十七页哦(二)几种亲合素(二)几种亲合素生物素染色技术生物素染色技术 v1 1 亲合素一生物素亲合素一生物素过氧化物酶复合物技术过氧化物酶复合物技术(ABC)(ABC)v2 2链酶亲合素链酶亲合素-生物素
6、生物素-过氧化物酶复合物技术过氧化物酶复合物技术(SABC(SABC法法)v3 3标记生物素标记生物素抗生物素技术抗生物素技术(LAB)(LAB)v4.SP/SAP4.SP/SAP法法v5.Envision5.Envision法法v6.CSA6.CSA法法第六页,讲稿共二十七页哦ABCABC复合物:复合物:亲和素生物素过氧化物酶亲和素生物素过氧化物酶亲和素生物素过氧化物酶亲和素生物素过氧化物酶复合物复合物1 1 亲合素一生物素亲合素一生物素过氧化物酶复合物技术过氧化物酶复合物技术(ABC)(ABC)第七页,讲稿共二十七页哦 基本原理基本原理 是将亲合素作为是将亲合素作为“桥桥”与生物素化的抗体
7、与生物素结合的酶(与生物素化的抗体与生物素结合的酶(HRP)HRP)连连接起来。接起来。第一抗体:第一抗体:为未标记特异性抗体,能结合组织中待测抗原;为未标记特异性抗体,能结合组织中待测抗原;第二第二抗体:抗体:为为生物素化的桥抗体生物素化的桥抗体,能与第一抗体结合;,能与第一抗体结合;第三抗体:第三抗体:是结合了过氧化物酶的亲合素复合物是结合了过氧化物酶的亲合素复合物(即即ABCABC)。优点:优点:敏感性强(比敏感性强(比PAP高高20-40倍);倍);特异性强,背景染色淡;特异性强,背景染色淡;方法简便,节约时间方法简便,节约时间(比(比PAPPAP缩短缩短2h2h);由于生物素与抗生物
8、素具有和多种示踪物结合的能力,可用于双由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。重或多重免疫染色。第八页,讲稿共二十七页哦 操作步骤操作步骤 冰冻切片或石蜡切片均可。冰冻切片或石蜡切片均可。冰冻切片:丙酮固定,冰冻切片:丙酮固定,PBS PBS 洗洗5min5min,更换,更换3 3次。次。石蜡切片:脱蜡,系列酒精至水。石蜡切片:脱蜡,系列酒精至水。第一抗体第一抗体孵育,过夜。孵育,过夜。PBSPBS洗洗5min5min,更换,更换3 3次。次。加加生物素标记的第二抗体生物素标记的第二抗体,孵育,孵育15min15min。PBS PBS洗洗5min5min,更换
9、,更换3 3次。次。加加ABCABC复合物复合物室温作用室温作用15min15min。PBSPBS洗洗5min5min,更换,更换3 3次。次。用用DABDAB显色。显色。复染、封片、观察。复染、封片、观察。结果结果 呈棕黄色为阳性表达,核被苏木精染成浅蓝色。呈棕黄色为阳性表达,核被苏木精染成浅蓝色。第九页,讲稿共二十七页哦(4)(4)注意事项注意事项 v消除内源性生物素:消除内源性生物素:染色前以染色前以0.010.01的亲合素和的亲合素和0.010.01生物素溶液分别作生物素溶液分别作用用20min20min以消除内源性生物素活性,每次作用后用以消除内源性生物素活性,每次作用后用PBSPB
10、S漂洗漂洗3 3次,次,5min5min。v消除内源性过氧化物酶:消除内源性过氧化物酶:可用可用3 3 H H2 2O O2 2孵育孵育5-105-10分钟以灭活内源性过氧化物酶分钟以灭活内源性过氧化物酶活性。蒸馏水洗活性。蒸馏水洗3 3次。次。v试剂的保存:试剂的保存:温度以温度以44为佳,可达为佳,可达2 2年之久,在年之久,在2020时其生物活性反时其生物活性反而在短期内被破坏。而在短期内被破坏。此外,生物素制剂之间相互亲和性差异大,注意厂家和批号。此外,生物素制剂之间相互亲和性差异大,注意厂家和批号。第十页,讲稿共二十七页哦SABC法原理:原理:一抗生物素化二抗一抗生物素化二抗SABC
11、SABC复合物复合物SABCSABC复合物复合物链霉卵白素生物素过氧化物酶链霉卵白素生物素过氧化物酶链霉卵白素生物素过氧化物酶链霉卵白素生物素过氧化物酶 生物素标记的二抗生物素标记的二抗链霉卵白素连接链霉卵白素连接 生物素标记的酶。生物素标记的酶。优点:优点:敏感性略高于敏感性略高于SPSP法,低背景和操作简便法,低背景和操作简便缺点:缺点:因体内含有内源性生物素,易产生非因体内含有内源性生物素,易产生非特异性染色。特异性染色。一抗一抗+生物素标记二抗生物素标记二抗+滴加试剂滴加试剂SABCSABC(链霉卵白素(链霉卵白素+辣根酶标记生物素辣根酶标记生物素)+)+辣根酶底物显色辣根酶底物显色2
12、 2 链酶亲合素链酶亲合素-生物素生物素-过氧化物酶复合物技术过氧化物酶复合物技术(SABC(SABC法法)第十一页,讲稿共二十七页哦SABCSABC试剂盒试剂盒(含正常血清,生物素化二抗,含正常血清,生物素化二抗,SABCSABC等等)操作程序操作程序1 1)载玻片防脱处理:可选择)载玻片防脱处理:可选择APESAPES或或PolyPolyLysineLysine,烤片。,烤片。2 2)切片常规脱蜡至水。)切片常规脱蜡至水。3 3)3 3H H2 20 02 2 灭活内源性酶。蒸馏水洗灭活内源性酶。蒸馏水洗3 3次。次。4 4)抗原热修复:将切片浸入枸橼酸盐缓冲液)抗原热修复:将切片浸入枸橼
13、酸盐缓冲液(PH6.0)(PH6.0),电炉或微波炉加,电炉或微波炉加热至沸腾后断电,间隔热至沸腾后断电,间隔5 51010分钟后,反复分钟后,反复1 12 2次。冷却后次。冷却后PBSPBS洗洗涤。涤。5 5)滴加)滴加5 5BSABSA封闭液,室温封闭液,室温2020分钟。甩去多余液体,不洗。分钟。甩去多余液体,不洗。6 6)滴加适当稀释的)滴加适当稀释的一抗一抗,371371小时左右或小时左右或202202小时左右。小时左右。也可也可44过夜。过夜。PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗2 2分钟分钟33次。次。对照切片用对照切片用PBSPBS代替一抗。代替一抗。第十二
14、页,讲稿共二十七页哦7 7)滴加)滴加生物素化二抗生物素化二抗,202037203720分钟。分钟。PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗2 2分钟分钟33次。次。8 8)滴加试剂)滴加试剂SABCSABC,202037203720分钟。分钟。PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗5 5分钟分钟44次。次。9 9)DABDAB显色:使用显色:使用DABDAB显色试剂盒。取显色试剂盒。取1ml1ml蒸馏水,加试剂盒中蒸馏水,加试剂盒中A A、B B、C C试剂各试剂各1 1滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应滴,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间
15、,一般在时间,一般在5 5一一3030分钟之间。蒸馏水洗涤。分钟之间。蒸馏水洗涤。1010)苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。)苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。结果结果 棕褐色为阳性结果,而细胞核染为淡蓝色。棕褐色为阳性结果,而细胞核染为淡蓝色。第十三页,讲稿共二十七页哦 注意事项注意事项 1 1)染色背景过高:)染色背景过高:在在SABCSABC反应之后,反应之后,DABDAB显色之前,用加有显色之前,用加有0.0l0.0l一一0.020.02TWEEN20TWEEN20的的PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗涤切片洗涤切片4 4次,单纯次,单纯P
16、BSPBS洗洗2 2次,然后次,然后DABDAB显色。显色。2 2)抗原热修复:)抗原热修复:可选可选0.01M0.01M枸橼酸盐缓冲液;枸橼酸盐缓冲液;也可以使用也可以使用PBSPBS、TBSTBS等多种缓冲液。等多种缓冲液。第十四页,讲稿共二十七页哦3 3 标记生物素标记生物素抗生物素技术抗生物素技术(LAB)(LAB)v原理:原理:第第抗体:抗体:生物素标记;生物素标记;第二抗体:第二抗体:酶标记抗生物素酶标记抗生物素(亲合素亲合素)v操作步骤:操作步骤:切片中加入切片中加入生物素标记一抗生物素标记一抗,室温孵育,室温孵育1 h1 h,。,。0.01MPBS0.01MPBS洗洗3 3次,
17、每次次,每次5 min5 min。20-50ug20-50ugml ml HRP-HRP-抗生物素抗生物素液孵育。液孵育。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。DABDAB显色。蒸馏水漂洗。显色。蒸馏水漂洗。苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。苏木精复染核。梯度乙醇脱水、透明、封片、镜检。应用不如应用不如ABCABC普遍,但手续较简便,但灵敏度低。普遍,但手续较简便,但灵敏度低。第十五页,讲稿共二十七页哦SPSP法(过氧化物酶标记的链霉卵白素法(过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色)标记的碱性磷酸酶染色)原理:原理:一抗生物素化二抗
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