引物设计初学者讲稿.ppt
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1、引物设计初学者第一页,讲稿共四十五页哦主要内容主要内容n n背景n nPCR引物设计原则n n常用PCR引物设计软件n nPrimer Premier 5.0 介绍n nOligo 6.22 介绍n n在线Primer3 介绍第二页,讲稿共四十五页哦PCR聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)(Polymerase Chain Reaction,PCR)是是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNADNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万
2、倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNADNA供分析研究供分析研究和检测鉴定。和检测鉴定。第三页,讲稿共四十五页哦PCR引物设计引物设计n n引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱,等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。第四页,讲稿共四十五页哦引物设计的原则引物设计的原则n n引物与模板的序列要紧密互补n n引物与引物之间避免形成稳定的二
3、聚体或发夹结构n n引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。第五页,讲稿共四十五页哦n n如引物长度(如引物长度(primer lengthprimer length),产物长度(product length),序列Tm Tm 值值(melting(melting temperature)temperature),引物与模板形成双链的内部稳定性,引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability,(internal stability,用用 G G 值反映),形成引,形成引物二聚体物二聚体(primer dimer)及发夹结构(及发夹结构(duplex du
4、plex formation and hairpinformation and hairpin)的能值,在错配位点)的能值,在错配位点(false priming sitefalse priming site)的引发效率,引物及产)的引发效率,引物及产物的物的GC GC 含量(含量(compositioncomposition),等等。必要时还),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。引进突变等。具体因素具体因素第六页,讲稿共四十五页哦一般原则一般原则n n引物的长度一般为引物的长度一般为15-30 bp15-30 bp,
5、常用的是,常用的是18-24 bp18-24 bp,但,但不应大于不应大于3838。n n引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大于引物过短又同时会引起错配现象,一般来说引物长度大于16bp16bp是必要的(不容易引起错配)。是必要的(不容易引起错配)。n n例如:一个长度为例如:一个长度为12bp12bp的引物在人类基因组上存在的引物在人类基因组上存在200200个潜在的退火位点个潜在的退火位点(3 x 10(3 x 109 9/4/41212=200).=200).而一个长度为而一个长度为20bp20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/4
6、001/400个个.n n较长的引物(较长的引物(28-35bp)28-35bp)n n一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点一些突变位点第七页,讲稿共四十五页哦n nTm值的计算n n一般的公式n nTm=4(G+C)+2(A+T)n n对于长一些的引物可用更为准确的n nnearest-neighbor(Frier et al.(1986))第八页,讲稿共四十五页哦一般原则一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也
7、会使错误引发机率增加。第九页,讲稿共四十五页哦一般原则一般原则3,引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。第十页,讲稿共四十五页哦一般原则一般原则4.引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%第十一页,讲稿共四十五页哦一般原则一般原则
8、5.G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低(绝对值不超过9),而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。(能值越高越容易结合)第十二页,讲稿共四十五页哦一般原则一般原则6.对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。第十三页,讲稿共四十五页哦一般原则一般原则7.引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。第十四页,讲稿共四十五页哦常用的引物设计软件常用的引物设计软件n nOligo 6(引物评价)*n
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