艾灸任脉的作用和功能_艾灸任脉经穴对脑缺血再灌注大鼠组织超微结构及巢蛋白表达的影响.docx
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1、艾灸任脉的作用和功能_艾灸任脉经穴对脑缺血再灌注大鼠组织超微结构及巢蛋白表达的影响 (广州中医药高校附属深圳市中医院,广东 深圳 518033) 摘 要:目的:视察艾灸任脉经穴对脑缺血再灌注大鼠纹状体组织超微结构及侧脑室下区巢蛋白(Nestin)表达的影响。方法:采纳线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型。72只SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、脑缺血再灌注模型组(MCAO)、模型+艾灸任脉治疗组(R)。用电镜视察脑缺血后组织超微结构及艾灸任脉对其的影响,并用免疫组化法视察艾灸任脉经穴对缺血侧侧脑室下区Nestin阳性表达的影响。结果:脑缺血损伤后各组大鼠纹状体的神经元、胶质细
2、胞及血管等均可见不同程度的缺血损害,艾灸任脉经穴对于改善组织缺血损害具有肯定的主动作用。模型组与假手术组相比,缺血侧侧脑室下区的Nestin的阳性表达均有不同程度的增加,其中再灌注7、14天差异有统计学意义(P 由于脑缺血本身诱导的神经干细胞较少,故探讨上调内源性神经干细胞的方法成为目前探讨的热点。祖国医学认为,任脉不但是治疗中风的常用经穴,同时亦具有调整胚胎发育的作用。以此思路为指导,笔者推论艾灸任脉经穴能够促进脑内的神经干细胞增殖,从而促进脑缺血损伤修复。本试验旨在视察艾灸任脉经穴对脑缺血损伤修复作用,并进一步从干细胞角度探讨其作用机制,为临床治疗脑缺血提高疗效及相识任脉的实质供应新的理论
3、依据。 1材料与方法 1.1试验动物及分组 SPF级成年健康雄性SD大鼠72只,由广州中医药高校试验动物中心供应,粤监证字2007A024。试验前体重(25010)g,饲养环境:室温 22,相对湿度 55%,12h昼夜节律,试验大鼠均自由进食及饮水,适应环境 1周后起先试验。术前禁食12h,随机分为假手术组(sham operation group, Sham)24只、模型组(MCAO group, MCAO)24只、艾灸任脉组(moxibustion Ren vessel treated group, R)24只。每组再分别随机分为7天组、14天组和28天组3个亚组。 1.2局灶性脑缺血大鼠
4、模型的建立 大鼠以3.5%水合氯醛腹腔麻醉(lmL/l00g体重),应用日本制尼龙线(直径0.235 mm)阻断右侧大脑中动脉血流,缺血2h后再灌注。参考Longa神经病学评分5评定神经功能缺损,评分为14分则造模胜利,用于试验。假手术组仅分别右侧颈总动脉并离断右颈外动脉,不予栓塞。 1.3治疗参数 艾灸任脉组(R):大鼠手术后24h予艾灸任脉经穴,取穴依据试验针刺学(上海科学技术出版社,1999 年9 月第1版)选取气海、关元两穴处剪毛,艾灸时将大鼠固定,局部碘酊消毒,用自制艾柱(长度约10cm,直径约0.8cm) 在穴位上方23cm处悬灸大约10min,采纳温柔灸补法,以大鼠出现难受及抽搐
5、为度,每日1次至动物处死。假手术组(Sham)和模型组(MCAO)于术后第2天将其如艾灸任脉组大鼠般固定于操作台上20min,并不作任何治疗。 1.4电镜视察组织超微结构 各组大鼠分别于再灌注后7天、14天及28天心脏灌注处死取脑,以手术刀片将纹状体部分切出大小1mm1mm1mm块状,置入2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定2h以上;0.1M PBS冲洗3次,每次10min;1%锇酸固定90min;0.1M PBS冲洗3次,每次10min;梯度酒精脱水:50%70%80%90%95%,漂洗1次,每次10min,再入100%乙醇2次,每次10min;无水丙酮:10min2次;渗透、Epon、包埋剂丙酮=
6、11,1h(摇);纯包埋剂6h或过夜;聚合24h,60;用超薄切片机将组织块切成6080nm厚的超薄切片;置菲利普 CMIO电镜下视察网孔中细胞形态及其超微结构的变更并摄片(中山医科高校电镜室)。 1.5 Nestin免疫测定各组大鼠分别于相应时间心脏灌注处死,于脑立体定位仪上行脑冠状切并取脑,将含侧脑室的组织置于44%多聚甲醛中后固定6h,然后将组织块脱水、透亮、浸蜡。组织蜡块以1m冠面切片,用浸泡过多聚赖氨酸的玻片裱片,并行烤片、脱蜡、水化、自来水冲洗;加入3%H2O2室温下孵育20min以灭活内源性过氧化物酶,然后放入0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复,滴加5%牛血清白蛋白
7、封闭液,室温下放置20min,甩去多余液体,不洗,滴加巢蛋白免疫组化单克隆抗体(MAB-0566 ,迈新公司),4下过夜,次日PBS冲冼3次5min,除去PBS液,每张切片滴加50L即用型MaxvisionTM试剂,室温下孵育1015min;PBS冲冼3次5min,除去PBS液,每张切片加100L簇新配置的DAB溶液,显微镜下视察35min。自来水冲洗,苏木素复染,PBS冲洗返蓝;切片经梯度酒精脱水,二甲苯透亮,中性树胶封片。 1.6图像分析与统计学处理 采纳德国Leica DC software数码图像分析系统进行图像分析。光镜下(2010倍),每张切片于缺血侧侧脑室下区选取5个相邻视野,以
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