酶的最新进展.ppt
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1、现在学习的是第1页,共62页第一节第一节 核酶核酶v核酶指一类具有催化功能的核酸。核酶指一类具有催化功能的核酸。v核酶的发现打破了酶是蛋白质的传统概念核酶的发现打破了酶是蛋白质的传统概念v早期发现的核酶都是早期发现的核酶都是RNARNA酶。酶。v19811981年美国罗拉多大学年美国罗拉多大学CechCech等发现四膜虫等发现四膜虫rRNArRNA中中I I型内含子具有自我剪接功能,型内含子具有自我剪接功能,19831983年年AtlmanAtlman等发现单独等发现单独RNARNA可催化可催化tRNAtRNA前体为成熟前体为成熟tRNAtRNA,具有,具有RNase PRNase P活性。活
2、性。v核酶的发现获得核酶的发现获得19891989年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。现在学习的是第2页,共62页 已发现已发现RNARNA核酶有几十种,其中的植物病毒、拟核酶有几十种,其中的植物病毒、拟病毒、卫星病毒、卫星RNARNA均以均以RNARNA为模板,以滚动的方式为模板,以滚动的方式复制复制RNARNA,自我切割是其,自我切割是其RNARNA生命周期不可缺少生命周期不可缺少的一环。的一环。现在学习的是第3页,共62页一、核酶的结构及催化机理一、核酶的结构及催化机理1 1、剪切型核酶的结构及催化机理、剪切型核酶的结构及催化机理(1 1)锤头状酶)锤头状酶典型二级结构:典型二级结构:v催化部分催化
3、部分v底物部分底物部分现在学习的是第4页,共62页循环剪切过程:循环剪切过程:底物和核酶结合,底物和核酶结合,剪切反应发生,剪切反应发生,产物释放,产物释放,核酶进入下一次催化过程。核酶进入下一次催化过程。现在学习的是第5页,共62页(2)发夹状核酶)发夹状核酶 最初在烟草斑点病毒的最初在烟草斑点病毒的卫星卫星RNARNA中发现。其具中发现。其具有可逆的自切割反应有可逆的自切割反应活性,使滚环复制的活性,使滚环复制的产物最终形成成熟的产物最终形成成熟的病毒核酸。病毒核酸。现在学习的是第6页,共62页 由于改变螺旋结构中的某些核苷酸序列并不由于改变螺旋结构中的某些核苷酸序列并不影响核酶的催化功能
4、,这一特性使人们可以影响核酶的催化功能,这一特性使人们可以人工设计发夹状核酶,人工设计发夹状核酶,特异性切割目的基因特异性切割目的基因,从而达到使基因沉默的目的。从而达到使基因沉默的目的。发夹状酶还具有:催化反应过程不需要金属离发夹状酶还具有:催化反应过程不需要金属离子的直接参与,推测在发夹状核酶介导的催化子的直接参与,推测在发夹状核酶介导的催化反应中,金属离子多行使的是稳定结构的作用,反应中,金属离子多行使的是稳定结构的作用,而且而且pHpH值变动对发夹状核酶催化反应的影响小。值变动对发夹状核酶催化反应的影响小。现在学习的是第7页,共62页(3 3)肝炎)肝炎病毒核酶病毒核酶 肝炎肝炎病毒(
5、病毒(HDVHDV)核酶来源于肝炎)核酶来源于肝炎病毒的基病毒的基因组因组RNARNA和反义基因组和反义基因组RNARNA。肝炎。肝炎病毒的基因病毒的基因组为单股环状负链组为单股环状负链RNARNA病毒,通过滚环机制进行病毒,通过滚环机制进行复制,产生的多聚体复制,产生的多聚体RNARNA链经过自我位点特异性链经过自我位点特异性的切割和连接形成子代共价闭合环状分子。的切割和连接形成子代共价闭合环状分子。现在学习的是第8页,共62页现在学习的是第9页,共62页(4)VS核酶核酶VSVS核酶来源于某种脉胞核酶来源于某种脉胞菌菌株的线粒体。菌菌株的线粒体。球状核酶,由球状核酶,由5 5个双螺个双螺旋
6、组成了两部分螺旋区。旋组成了两部分螺旋区。现在学习的是第10页,共62页通用的催化机理通用的催化机理现在学习的是第11页,共62页(二)剪接型核酶的结构及催化机理(二)剪接型核酶的结构及催化机理 剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子。去内含子。(1 1)I I型内含子的自我剪接型内含子的自我剪接L19L19是最早发现的是最早发现的I I型内含子,特征:型内含子,特征:拼接点序列为拼接点序列为5U.G35U.G3中部核心结构中部核心结构内部引导序列内部引导序列剪接通过转酯反应进行剪接通过转酯反应进行现在学习的是第12页,共62页现在学习的是
7、第13页,共62页型内含子所催化的典型反应是包括两步磷型内含子所催化的典型反应是包括两步磷酸酯键转移反应的酸酯键转移反应的RNARNA剪接反应。剪接反应。另外带有另外带有I I型内含子的前体在型内含子的前体在33剪接位剪接位点上海特别容易发生特异性自发水解,水解点上海特别容易发生特异性自发水解,水解反应无需外源反应无需外源G G的参与。的参与。现在学习的是第14页,共62页现在学习的是第15页,共62页(2)型内含子的自我剪接型内含子的自我剪接在真菌、原核生物、植物的在真菌、原核生物、植物的rRNArRNA、tRNAtRNA、mRNAmRNA中已发现了中已发现了100100多种,其代表分子式酵
8、母线粒多种,其代表分子式酵母线粒体细胞色素氧化酶体细胞色素氧化酶mRNAmRNA前体。前体。型内含子结构有型内含子结构有3 3部分组成:边界序列部分组成:边界序列5GUGCG.YANAG,35GUGCG.YANAG,3茎环结构以及分支点茎环结构以及分支点序列组成。序列组成。剪接机制与剪接机制与I I型内含子的剪接机制类似,不过它型内含子的剪接机制类似,不过它无需鸟苷的辅助,但需镁离子的存在。无需鸟苷的辅助,但需镁离子的存在。现在学习的是第16页,共62页现在学习的是第17页,共62页(3)RNAase P核酶核酶由由RNARNA和蛋白质构成的复合体。和蛋白质构成的复合体。RNARNA组分是真正
9、的活性中心,其成分高度保守。组分是真正的活性中心,其成分高度保守。核酸内切酶,参与所有原核核酸内切酶,参与所有原核tRNAtRNA初始转录产物初始转录产物55末端的加工成熟过程。末端的加工成熟过程。现在学习的是第18页,共62页 前体前体tRNAtRNA在在tRNAtRNA剪切酶的作用下,被切成一定大剪切酶的作用下,被切成一定大小的小的tRNA tRNA 分子。分子。现在学习的是第19页,共62页二、脱氧核酶二、脱氧核酶v脱氧核酶是指具有催化功能的分子。脱氧核酶一脱氧核酶是指具有催化功能的分子。脱氧核酶一般的获得方法是体外选择。般的获得方法是体外选择。v先合成一个随机的多核苷酸单链先合成一个随
10、机的多核苷酸单链DNADNA库,其中每一条库,其中每一条链的两端的序列式固定队,以此随机单链库为模板,链的两端的序列式固定队,以此随机单链库为模板,进行进行PCRPCR扩增,而且引物的扩增,而且引物的55端还包含有一个生物素端还包含有一个生物素基团,用于以后的亲和柱分离。在一定的反应条件下使基团,用于以后的亲和柱分离。在一定的反应条件下使PCRPCR扩增产物进行自我裂解,若有切割反应发生,被切割扩增产物进行自我裂解,若有切割反应发生,被切割的分子即被洗脱下来,从而完成第一轮筛选。再经的分子即被洗脱下来,从而完成第一轮筛选。再经PCRPCR进进行下一轮选择,经过多次筛选即可产生具有催化功行下一轮
11、选择,经过多次筛选即可产生具有催化功能的分子。再将产物克隆、测序,就可得到具有自能的分子。再将产物克隆、测序,就可得到具有自我裂解活性的我裂解活性的DNADNA分子序列。分子序列。现在学习的是第20页,共62页1 1、具有水解酶活性的脱氧核酶、具有水解酶活性的脱氧核酶 以以RNARNA为底物的脱氧核酶最典型的为为底物的脱氧核酶最典型的为10-23DRz10-23DRz,包括底物结合臂和催化序列两部分。包括底物结合臂和催化序列两部分。现在学习的是第21页,共62页2 2、具有、具有N-N-糖基化酶活性的糖基化酶活性的DRzDRz 专一性水解嘌呤碱基的专一性水解嘌呤碱基的N-N-糖苷键,促使脱氧胞
12、嘧糖苷键,促使脱氧胞嘧啶的啶的N-N-糖苷键发生水解反应,导致糖苷键发生水解反应,导致DNADNA链在腺嘌链在腺嘌呤位点处被切断,产生一个脱嘌呤位点(呤位点处被切断,产生一个脱嘌呤位点(APAP位点)位点),使该位点,使该位点DNADNA的遗传信息片段丢失。的遗传信息片段丢失。3 3、具有连接酶活性的、具有连接酶活性的DRzDRz 催化与它互补的两个催化与它互补的两个DNADNA片段之间形成磷酸二片段之间形成磷酸二酯键连接成一个酯键连接成一个DNADNA分子。分子。现在学习的是第22页,共62页三、核酶的应用和最新进展三、核酶的应用和最新进展 核酶和脱氧核酶与反义药物不同,它们具有核酶和脱氧核
13、酶与反义药物不同,它们具有催化活性,即一个核酸分子可裂解多个靶催化活性,即一个核酸分子可裂解多个靶RNARNA分子,能够避免反义在活性浓度低时的分子,能够避免反义在活性浓度低时的诸多毒副作用,加之核酸不编码蛋白质而不产诸多毒副作用,加之核酸不编码蛋白质而不产生免疫原性,在应用上具有更大的潜力。生免疫原性,在应用上具有更大的潜力。现在学习的是第23页,共62页1 1、在抗病毒方面的研究、在抗病毒方面的研究 是一种逆转录病毒,是核酶应用研究的理想靶标。是一种逆转录病毒,是核酶应用研究的理想靶标。2 2、针对肿瘤基因的研究、针对肿瘤基因的研究核酸用于肿瘤治疗主要机制是裂解癌细胞。核酸用于肿瘤治疗主要
14、机制是裂解癌细胞。3 3、靶标识别、靶标识别反向基因组策略。反向基因组策略。4 4、其他方面的研究、其他方面的研究 核酸可作为生物传感器分子在分子水平快速和微量分析细核酸可作为生物传感器分子在分子水平快速和微量分析细胞的生化状态以及胞的生化状态以及RNARNA的结构和蛋白质分子的状态。的结构和蛋白质分子的状态。现在学习的是第24页,共62页四、核酶研究中的问题以及对策四、核酶研究中的问题以及对策1.1.核酶的选择核酶的选择2.2.核酶的靶选择性核酶的靶选择性3.3.核酶的催化效率核酶的催化效率4.4.核酶的稳定性核酶的稳定性现在学习的是第25页,共62页第二节第二节 模拟酶模拟酶 模拟酶又称人
15、工合成酶,是一类利用有机化模拟酶又称人工合成酶,是一类利用有机化学方法合成的比天然酶简单的非蛋白质分子。学方法合成的比天然酶简单的非蛋白质分子。v底物结合位点底物结合位点v催化位点催化位点现在学习的是第26页,共62页模拟酶的性质模拟酶的性质具有一个良好的疏水键合区来和底物发生相互作具有一个良好的疏水键合区来和底物发生相互作用;用;能与底物形成静电或氢键等相互作用,并以适能与底物形成静电或氢键等相互作用,并以适当的方式相互键合;当的方式相互键合;模拟酶的结构对底物键合方向应该有立体化学模拟酶的结构对底物键合方向应该有立体化学专一性。专一性。现在学习的是第27页,共62页目前对于天然酶的模拟主要
16、从一个层次进行:目前对于天然酶的模拟主要从一个层次进行:合成类似酶活性的简单配合物;合成类似酶活性的简单配合物;酶活性中心模拟:在天然或人工合成的化合物酶活性中心模拟:在天然或人工合成的化合物中引入某些活性基团,使其具有酶的催化能力。中引入某些活性基团,使其具有酶的催化能力。整体模拟:包括微环境在内的整个酶活性整体模拟:包括微环境在内的整个酶活性部位的化学模拟。部位的化学模拟。现在学习的是第28页,共62页一、环糊精一、环糊精环糊精是直链淀粉在芽孢杆菌产生的环糊精葡萄环糊精是直链淀粉在芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称
17、。称。它是由几个它是由几个D D(+)-葡萄糖残基,通过葡萄糖残基,通过-1,4-1,4-糖苷键连接而成,聚合度分别为糖苷键连接而成,聚合度分别为6 6个、个、7 7个或个或8 8个葡萄糖,依次称为个葡萄糖,依次称为、-环糊精。环糊精。把类似于酶活性基团的小分子修饰到环糊精上,把类似于酶活性基团的小分子修饰到环糊精上,则可以使模拟酶具有对有机化合物的催化水解、则可以使模拟酶具有对有机化合物的催化水解、转氨基以及氧化还原等。转氨基以及氧化还原等。现在学习的是第29页,共62页现在学习的是第30页,共62页1 1、水解酶的模拟、水解酶的模拟 早期人们发现环糊精的氧负离子可与羧酸酯反应,早期人们发现
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