《HPLC方法学》PPT课件.ppt
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1、1总论 2卓有成效的工作方法3样品的性质和预处理4分离的基础5系统方法的建立6保证柱寿命和性能的步骤绝大多数实验室中,HPLC方法的建立仍在靠经验进行首先进行反相色谱实验,调整流动相中有机相的比例,以求得足够的分离度、合理的操作时间以及易于检测的谱带。改用不同的色谱柱,改变温度和流动相pH值,优化筛选溶剂的配比组成,以其它溶剂代替原来有机溶剂。或者试用别的HPLC方法1 首先估价样品与分离目的(切不可低估此步的重要性)2设计开始的分离条件,使之有可能在一两次实验中,便可能得到有希望的色谱图。3 预测可能发生的问题,当问题出现时,能用已知的办法解决。4 有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。
2、5 应对每次实验进行设计,能提供有用信息。6 HPLC的目的是分离,而不必使所需谱峰“过渡分离”。可直接进样的样品溶液需稀释缓冲pH或添加另一液体的溶液能在流动相中溶解的固体含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前 将其去除的溶液含有不容性赋性剂的混合物(动植物组织,高交联度聚合物、干性黏合剂)绝大多数样品需经称重或稀释后进样,一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。要分离好的好,有两条途径:一是谱带窄,即柱效高;再就是谱带间距离大。Rs=(t2-t1)/(1/2(w1+w2)t1,t2 为二相邻谱带间的保留时间,w1和w2为它们基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs时 为完全分离。当峰发生重叠时,
3、难以准确测量到基线处的峰宽,更的办法好是用半高处的相应峰宽1和2:Rs=1.18(t2-t1)/(1+2)Rs在一般情况下,能达到99的分离度。新柱的起始色谱图的Rs值越大,意味着该柱用此法时间越长。Rs时 定量分析一般精密度较差。Rs=(1/4)(-1)Nk/(1+k)k代表了溶剂强度;为分离因子;N为理论塔板数。溶剂强度的增大,Rs增大,满意的范围1 k20在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。柱类型不同,选择性也不一样,这与键和相有关。温度的选择性,温度的变化会影响分离度,因为理解的程度与温度有关。一般塔板数越大,分离度越好合格的HPLC的塔板数,一般不应低于
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